【实验目的】
（1）掌握SDS-PAGE分离蛋白质的原理。
（2）掌握用SDS-PAGE检测蛋白质的方法及操作过程。
【实验原理】
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）。1967年，Shapiro等人首先发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中加入一定量的SDS，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的相对分子质量大小。
SDS是1种阴离子型去垢剂，带负电荷。因此，蛋白质在含有强还原剂的SDS溶液中与SDS分子结合时，可形成SDS-蛋白质复合物。这种复合物由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，使蛋白质本身带有的电荷被掩盖，起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用，因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小，从而达到分离目的蛋白的目的。同时，SDS-PAGE可以测定蛋白质的相对分子质量。当蛋白质的相对分子质量在15000～200000时，样品的迁移率与其相对分子质量的对数呈线性关系，符合以下方程式：
lg Mr＝－b×mR＋K
式中，Mr为蛋白质的相对分子质量；
mR为相对迁移率；
b为斜率；
K为截距。当条件一定时，b与K均为常数。
因此，通过已知相对分子质量的蛋白与未知蛋白的迁移率比较，就可以得出未知蛋白的相对分子质量。
【实验材料、试剂及仪器】
1．实验材料
实验31获得的经不同时间诱导的大肠杆菌。
2．实验试剂
（1）30％丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺29g，N，N′-亚甲基双丙烯酰胺1g，溶于60mL水中，加热至37℃溶解，定容到100mL，用0.45μm滤膜过滤，室温避光保存。
（3）分离胶缓冲液：1.5mol/L Tris-HCl（pH8.8）。称取Tris36.3g，溶于200mL蒸馏水中，用浓盐酸调pH至8.8。
（4）浓缩胶缓冲液：1.0mol/L Tris-HCl（pH6.8）。称取Tris12.1g，溶于200mL蒸馏水中，用浓盐酸调pH至6.8。
（5）10％过硫酸铵溶液：过硫酸铵1g加蒸馏水水定容到10mL，4℃下可贮存1周，但最好现配现用。
（6）四甲基乙二胺（TEMED）。
（7）10％（m/V）SDS溶液：称取10g SDS于100mL蒸馏水中，微热使其溶解。贮存液保存于室温，用前微热，使SDS完全溶解。
（8）5×Tris-glycine电泳缓冲液：称取Tris15.1g，甘氨酸94g，10％SDS50mL，加蒸馏水定容至1000mL。
（9）1mol/L DTT溶液：20mL0.01mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）中溶解3.09g二硫苏糖醇（dithiothreitol, DDT），过滤除菌后分装成1mL每份，－20℃贮存。
（10）2×SDS凝胶上样缓冲液：100mmol/L Tris-HCl（pH6.8），200mmol/L DTT（不含DTT的凝胶加样缓冲液800μL＋1mol/L DTT200μL。DTT现用现加。），4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油。
（11）染色液：称取考马斯亮蓝R2500.25g，溶于90mL蒸馏水中，加甲醇90mL，再加入冰乙酸10mL，搅拌使之充分溶解，必要时滤去颗粒状物质。
（12）脱色液：甲醇/冰乙酸/水（V∶V∶V＝3∶1∶6）。
（13）蛋白质分子大小标准参照物。
3．实验仪器
SDS-PAGE装置（每4人1套）
微量移液器（每2人1套）
高速离心机（每4人1台）
恒温摇床（全班1台）
－20℃冰箱（全班1台）
恒温水浴锅（每4人1台）
高压灭菌锅（全班1台）
电子天平（每8人1台）
1．5mL离心管（若干）
各种规格吸头（若干）
【实验步骤】
1．SDS—聚丙烯酰胺凝胶的灌制
（1）根据说明书安装玻璃板。
（2）按表14.1所示配制10％分离胶溶液。
表14.1 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳10％分离胶溶液配制表
（3迅速在两玻璃板的间隙中灌注10％分离胶溶液，留出灌浓缩胶 所需空间（梳子齿长＋1cm），覆一层重蒸水（覆盖水层可防止因氧气扩散进入凝胶而抑制聚合反应），将凝胶垂直放于室温下，大约20～40min后胶即聚合。
（4）倒出覆盖水层，用去离子水洗涤凝胶顶部数次以除去未聚合的丙烯酰胺后，尽可能排去凝胶上的液体，最后用滤纸条吸净残留液体。
（5）按下表所示配制5％浓缩胶（本实验配制2～3mL即可）。
表14.2 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳5％浓缩胶溶液配制表
（5）由于加入TEMED后浓缩胶马上开始聚合，故应在已聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，然后立即在浓缩胶中插入干净的梳子，此时应小心避免混入气泡，再加入浓缩胶以充满梳子之间的空隙，待浓缩胶凝聚（约30min）后，拔除梳子。用去离子水洗涤梳子数次以除去未聚合的丙烯酰胺，并用滤纸条吸干残留液体。
2．样品的制备及电泳
（1）将1.5mL细菌培养液经10000r/min离心2min，收集菌体，存于－20℃冰箱中备用。将储存的菌沉淀样品＋5μL蒸馏水＋5μL2×SDS凝胶上样缓冲液在1个离心管中混合，100℃加热5min后，取出冷却至室温，12000r/min离心1min，取上清液。
（2）装好电泳系统，加入电泳缓冲液，上样8μL。
（3）将电泳装置与电源连接，在凝胶上加8V/cm电压，待染料前沿进入分离胶后将电压提高到15V/cm继续电泳，直至溴酚蓝达到分离胶的底部。电泳过程约需80～150min。
（4）卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色过夜。加入脱色液，置于80r/min脱色摇床上，每20min更换1次脱色液至完全脱净。
（5）将脱色后的凝胶照相或干燥，也可用塑料袋密封在20％甘油水溶液中长期保存。
【典型实验结果分析】
理想实验结果（见图14.2，泳道3，4）含有外源基因的*质粒的菌株经IPTG诱导后表达出目的蛋白片段。而不含*质粒的菌株则不表达该蛋白片段。
图14.2 大肠杆菌外源基因表达蛋白的SDS-PAGE结果
1：蛋白质分子大小标准参照物；2～3：表达蛋白样品；4：空白对照
【实验注意事项】
（1）实验组与对照组所加总蛋白含量要相等。
（2）为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的pH值要准确，10％AP在一周内使用。室温较低时，TEMED的量可加倍。
（3）未聚合的丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护。
（4）在“实验步骤”1中（2）、（4）配制溶液时，一旦加入TEMED，胶马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作
（5）【参考文献】
［1］杨安钢等．生物化学与分子生物学实验技术．北京：高等教育出版社，2008.
［2］梁宋平．生物化学与分子生物学实验教程．北京：高等教育出版社，2002.
［3］郭勇．现代生化技术．广州：华南理工大学出版社，2001.
［4］Boyer RF. Modern Experimental Biochemistry. Addison-Wesley Publishing Company Inc, 2000.
［5］Hanahan D, Jessee J, and Bloom FR. Plasmid transformation of E. coli and other bacteria. Methods in Enzymology, 1991, 204: 63～113.
