1860年进入梁赞教会中学，1864年毕业后进入梁赞教会神学院。准备将来做传教士。19世纪60年代，他深受俄国伟大的民主主义者赫尔岑、别林斯基、车尔尼雪夫斯基等进步思想的影响。在此期间从皮萨列夫的文章《动植物世界的进步》中，他知道了达尔文的进化论，并受苏俄著名生理学家谢切诺夫《脑的反射》一书影响，他对自然科学发生兴趣，逐渐放弃神学。
1870年，21岁的他和弟弟一起考入圣彼得堡大学，先入法律系，后转到物理数学系自然科学专业。大学期间，尽管巴甫洛夫因学习优异并且年年获得奖学金，但是生活还是比较清贫，需要给别人做家庭教师才能维持日常生活。为了节省车费他每天都要步行走很远的路。
大学三年级时，他上了齐昂教授的生理学课程，对生理学和实验产生了浓厚兴趣，从此开始投入生理学的研究。为使实验做得得心应手，他刻苦练习，渐渐地相当精细的手术他也能迅速完成，齐昂很欣赏他的才学，叫他做自己的助手。在齐昂的指导下，1874年，他与同学一起完成了第一篇科学论文《论支配胰腺的神经》，获得研究金质奖章。
1875年，巴甫洛夫获得了生理学学士学位。再进外科医学学院攻读医学博士学位，在此期间成为了自己老师的助教。1878年，他应俄国著名临床医师波特金教授邀请，到他的医院主持生理实验工作，所谓实验室，其实就是一间破屋子，它既像看门人的住房，又像一间澡堂，巴甫洛夫却在这里工作了十余年。在这里，他主要研究血液循环、消化生理、药理学方面的有关问题。
