随着剧情向后推进，新角色不断引入，老角色的细节也得到了展现。拉斐尔和多纳泰罗的个性取自两位作者：凯文冲动易怒，皮特冷静睿智，两人一热一冷，优缺互补。女主角艾普莉尔（April）在第2期作为科学家的实验室助手登场。
（外星种族阿特姆）
外星种族阿特姆（Utrom）在第3期首次亮相，这是一个造型类似大脑的种族，靠机械伪装成人类潜伏在纽约，变种物质就是他们发明的，大部分阿特姆热爱和平，只有少部分成为好战之徒。但到了动画，这个角色变成了反派，我们下面再讲。
当漫画销量来到12.5万册时，一位名叫马克•福瑞曼的生意人加入了蒸蒸日上的团队，成为《TMNT》的经营执照代理人。后来的事实证明，具备独到商业眼光的马克加盟，成为“少年变异忍者龟”从一部畅销漫画升格为世界级商业品牌的转折点。
（马克和两位作者合影）
在漫画大获成功之际，马克将目光集中衍生品开发上，与彩星玩具公司签订了生产协议，该公司为玩具生产设置了一个先决条件：“用电视动画片进行辅助营销”，而正是这一决定，揭开了《TMNT》的电视动画片时代。
1987年，当彩星公司和村上-沃尔夫-斯文森工作室联合推出动画时，邀请了以戴维•怀斯为首的团队开始了动画设定和故事编写的工作。戴维•怀斯是美国知名编剧，曾参与《星际旅行》、《希曼》、《变形金刚》、《蝙蝠侠》等动画的创作，曾创作了变形金刚G1动画中重要的两集《魔力神球》和《回到过去》。
这次他们面临了诸多挑战，其中一个令人头疼的问题是，如何让孩子们将黑白的漫画中除了武器之外看起来一模一样的四人区分开来？最终的解决方案是：在皮带扣上写好每人名字的首字母，并为四位忍者龟配备专属颜色的头带及护具：莱昂纳多为蓝色，拉斐尔为红色，多纳泰罗为紫色，米开朗基罗为橙色。这一改动日后被所有版本的漫画动画和电影继承，成为“忍者神龟”最为著名的形象标志。
而麻烦的是《忍者神龟》的漫画内容和画风十分成人化，打斗场面各种刀光剑影，血肉横飞，如果直接改编动画肯定是无法面向孩子的。于是他们花费了很多精力在突出动画的喜剧效果，弱化暴力成分上。四只神龟从雷厉风行的反犯罪斗士变成了诙谐幽默，喜欢电视电影，爱好跳舞等活动的“时尚少年”。他们的身上没了斑斑血迹，龟壳上少了道道伤疤，却新增了刻着自己名字首字母的腰带扣，相貌也可爱了不少。还在漫画的基础上突出了神龟的性格特色——双刀的莱昂纳多具有领导才能，耍棍的多纳泰罗擅长技术发明，使叉的拉斐尔最脾气火爆，而米开朗基罗是个无忧无虑的乐天派，这些都是戴维怀斯为首的动画编剧团队的杰作。怀斯还想出了一个神龟们最让大家印象深刻的属性——“爱吃披萨”。这样的设定完全是为了让神龟们更为亲民——“这个世界上难道会有不爱披萨的孩子吗？”
其他角色设定上动画也有一定调整。斯普林特大师的形象虽然没变，但原本漫画里他是忍术大师滨户良的宠物老鼠变异而成，在动画里改成了由他本人变异而来，编剧怀斯还将常常跟神龟们眉来眼去的艾普利尔也从普通的程序员变成了电视台美女新闻记者，因为他认为女主角应该是个类似《超人》中的路易斯的角色，这样就能让其合理地碰到各种奇怪的事件，不断地陷入危机，不断地被神龟所救。
