《蒙娜丽莎》是一幅享有盛誉的肖像画杰作，它代表了达·芬奇最高的艺术成就。该画成功地塑造了资本主义上升时期一位城市富有阶层的妇女形象。画中人物坐姿优雅，笑容微妙，明亮的眼睛、纤细的睫毛、垂落在肩上的柔软的而微微卷曲的头发都惟妙惟肖。画家也特别注重精确与含蓄相结合，使人物的内心和美丽的外表完美统一，从而使蒙娜丽莎的微笑具有一种神秘莫测的千古神韵，那如诗如梦的妩媚微笑，被不少美术史家称为“神秘的微笑”。蒙娜丽莎交叉的双手描绘得柔嫩、精确、丰满,完全符合解剖结构，展示了画中人物温柔的性格，更体现了她的身份和阶级地位。并且蒙娜丽莎神秘的微笑与交叉的双手构成了完整的组合，造型极为优雅，把主人公的神韵完美地体现了出来。达·芬奇精湛的画技和敏锐的观察力可以想象是多么高超。
从绘画技巧上来看，这幅画的构图，达·芬奇改变了以往肖像画多采用半身或截至胸部的习惯，代之以正面的胸像构图。透视点略微上升，使构图呈金字塔形，从而使蒙娜丽莎显得更加端庄和稳重。在对背景山水的处理上，画家淋漓尽致地发挥了他那奇特的烟雾状“空气透视”的笔法。这样就把肖像后面的山崖、小径、石桥、树丛和潺潺的流水都推向遥远的深处，更加突出了人物形象。并且人物两边的远景并不在同一水平线上，右边视平线显得较高，这样的处理使人物层次感分明，当我们集中看右边时，我们会觉得远景上升，人物下降；当我们集中看左边时，会觉得远景下降而人物上升。随着观察者观察侧重点的不同，人物五官的位置，似乎也在随之移动。
画家还精心处理了所有物体的轮廓，以至于观者很难从中找到一条清晰而实在的边线。相反，在每一处形体发生转折的部位，却可以感觉到无数细腻而微妙的层次过渡。在色彩的运用方面，虽然此作品中并没有明快亮丽的色彩，但明暗对比法更好地表现出了画面的各种关系，使画面显得整齐、凝练，达到了删繁就简的奇特效果。并且，达·芬奇对画中人物微妙至极的表情处理，也拿捏得恰如其分。比如对人像面容中眼角、唇边等表露感情的关键部位的把握就极为准确、传神、栩栩如生。
达·芬奇的《蒙娜丽莎》不仅继承了希腊古典主义庄重、典雅、均衡、稳定和富有理想化、理性化的表现规范，而且又进一步突破了希腊古典艺术在人本特质上的局限，触及到了人物更深层的精神世界，为后来的艺术家在表现人物更深层、更内在、更微妙的精神方面树立了典范，提供了借鉴。而后世人对于画中人物真实身份的猜疑以及对达·芬奇精湛画技的诸多评论和玄想更为这幅画增添了神秘色彩。
