猫用干扰素一天打几次,给猫打干扰素的正确方法

已经提出施用*猫干扰素-ω(rFeIFN)来预防犬和猫细小病毒病。在本研究中，在最初施用rFeIFN后几天，在因猫细小病毒(FPV)感染而爆发猫泛白细胞减少症的猫舍中，评估了施用rFeIFN对炎症血液标记物(α-球蛋白、α1-酸性糖蛋白)和免疫系统激活(γ-球蛋白、IgG、IgM、特异性抗猫细小病毒IgG或IgM)的影响。给小猫(n = 23)注射rFeIFN (1 MU/kg皮下注射，每天一次，持续3天),并将它们的血液参数与17只未治疗的猫的血液参数进行比较。在最后一次rFeIFN给药后1个月，对疫情中幸存的猫进行接种并重新取样。两组患者出现临床症状的时间和生存率无显著差异。感染后存活的对照和治疗猫具有高水平的γ-球蛋白、总抗FPV和特异性IgG，可能是由于母体免疫的被动转移。与对照组相比，治疗组小猫的a1-球蛋白水平较低，而γ-球蛋白和免疫球蛋白的平均值较高。疫苗接种后收集的样本数据显示，与对照组相比，治疗组小猫的γ-球蛋白、总特异性IgG和抗FPV特异性IgG水平较高，表明rFeIFN刺激抗体产生。基于这一结果，应将rFeIFN注射给母猫，以增加母源被动免疫力，或在将小猫引入可能受到污染的环境之前注射给小猫。

关键词：干扰素ω；猫泛白细胞减少症；细小病毒；AGP；电泳；免疫球蛋白

“干扰素家族”包括具有非特异性抗病毒、抗增殖、抗炎和免疫调节活性的细胞因子。具体而言，I型干扰素（IFN）包括IFN-a、IFN-b和IFN-ω（Wonderling et al., 2002）。I型IFN由病毒感染的细胞产生，并与相邻细胞上的特定受体相互作用，这些受体被诱导转录编码抗病毒蛋白的基因。因此，病毒复制和病毒蛋白质合成减少(Ueda et al., 1993b; Uchino, 1995; Tilg, 1997; Stark et al., 1998; Wonderling et al., 2002)。II型干扰素包括由T淋巴细胞和NK细胞产生的IFN-g(Wonderling et al., 2002)。IFN-γ具有普遍的免疫调节活性，其特征是巨噬细胞、T淋巴细胞、NK细胞以及B细胞的活化（Mond et al., 1986; Bohem et al., 1997）。已经证明几种病毒类型可以调节IFN的产生（Uchino, 1995; Stark et al., 1998）。此外，在病毒性疾病流行率高的人群中或在病毒感染的早期阶段施用外源性IFN会抑制病毒复制。因此，IFN的施用可显示预防效果或可防止某些病毒性疾病的恶化（Truyen et al., 2002）。外源性人干扰素的施用不会在猫身上引起严重的副作用（Muäller，2002），但作为外源性抗原，可诱导产生中和抗体，抑制活性成分的治疗作用（Zeidner et al., 1990; Muäller, 2002）。施用特定于物种的猫科动物IFN能够绕过这个问题（Muäller, 2002; Truyen et al., 2002）。
*猫IFN-ω (rFeIFN)与人IFN有65%的同源性(Ueda et al., 1993b)，并具有与人IFN-ω相似的抗病毒、药物代谢动力学和药理学特性(Ueda et al., 1993a,b)。在体外，rFeIFN对包括细小病毒、疱疹病毒、杯状病毒、冠状病毒和轮状病毒在内的几种病毒具有已证实的抗病毒作用(Mochizuki et al., 1994; Mu ̈ller, 2002; Truyen et al., 2002)。在体内，rFeIFN主要用于患有实验性或自发性细小病毒感染的犬，具有随后的临床改善、CBC结果的正常化和死亡率的降低(Ishiwata et al., 1998; Minagawa et al., 1999; Martin et al., 2002)。在犬中，rFeIFN也已经成功地用于与疫苗接种相关的预防犬细小病毒病的爆发(Uchino，1995)。还报道了rFeIFN在患有猫传染性腹膜炎或感染了猫免疫缺陷病毒、猫白血病病毒和猫杯状病毒的猫中的功效(Uchino, 1995; Mihaljevic, 2003; De Mari et al., 2004; Ishida et al., 2004)。然而，没有关于rFeIFN在由猫细小病毒(FPV)引起的自发性猫泛白细胞减少症(FP)病例中的作用的数据。在患有FP的小猫中使用rFeIFN似乎不会影响疾病的进程(个人观察)。尽管如此，在rFeIFN将调节炎症或免疫反应的情况下，rFeIFN的施用可以整合到常规治疗中，或者可以考虑用于预防猫患FP的计划。
因此，本研究的目的是调查rFeIFN给药对生活在以FPV感染率高为特点的救援收容所中的小猫的炎症和免疫反应的可能影响，并在FP暴发前进行治疗。

血清样品收集自生活在救援收容所的猫，该收容所每年收容大约80只成年猫和250多只小猫。之所以选择这个庇护所，是因为它记录了幼猫在初夏时反复出现的严重的FP爆发。

所有年龄在50-70天的小猫都被纳入了这项研究。它们被随机分为两组:17只“对照组”不接受治疗，23只“治疗组”接受1 MU/kg的rFeIFN (Virbagen omega, Virbac, Carros Cedex，法国)皮下注射，每天一次，持续3天，就像对受其他病毒性疾病影响的猫的建议一样(Ishida et al.，2004)。大约在预期的FP爆发时间前1周，转诊兽医开始给“治疗组”使用rFeIFN。

在rFeIFN给药后(第0天)，所有的猫接受32天的完整的每日身体检查。记录任何异常临床发现或任何死亡，特别是在符合猫泛白细胞减少症的临床症状的情况下。在出现临床症状的情况下，对对照组和治疗组的小猫都进行支持性治疗(根据普遍的临床症状选择)。

在第5天至第11天期间，从9只对照猫和12只接受治疗的猫（无论是否存在临床症状）采集血样。

在两组中的每一组中，随机选择了7只在暴发后仍存活且无症状的猫，并在rFeIFN给药后7或14天接种了猫泛白细胞减少症、杯状病毒和疱疹病毒（Feligen CRP，Virbac）疫苗。

第32天，从2只接种疫苗的对照组和5只接种疫苗的治疗猫中采集额外的血液样本。

血液取自颈静脉并放入普通试管中。血液样本立即提交给实验室，并进行盲处理。通过离心获得血清，分离并在-20℃下储存，直到分析。

在24只具有与猫细小病毒病一致的临床症状死亡的猫中，有9只进行了完整的死后检查(5只来自对照组，4只来自治疗组)。

采用离散分析仪(EOS-BRAVO, Hospitex, Fire- nze, Italy)采用Biuret法(Hospitex Firenze, Italy)测定28份血清样本中的总蛋白。血清蛋白电泳采用半微法，用聚乙酸纤维素条(SEAC, Firenze, Italy)在巴比妥和三脂缓冲液(Helena Lab.Italia Spa，Assago，MI，意大利)中进行。。条带在150 V下运行40分钟，然后在Red Ponceau (0.5 g在100ml5%三氯乙酸中)中染色15分钟，在5%乙酸中染色，并放入蒸发溶液中(Helena Lab. Italia Spa)。凝胶在密度计中扫描(BT512, Biotecnica Instruments, Roma, Italy)。

根据制造商的说明，使用放射免疫扩散(RID)试剂盒测量IgG、IgM (VET-RID，Bethyl Laboratories，Inc .，Montgomery，USA)和AGP (Tridelta Ltd .，Dublin，Ireland)。

使用商用的涂有由FPV株TN/CEK-3感染的Crandell猫肾细胞的多孔玻片（VMRD Inc., Pullman, WA, USA）评估特异性抗细小病毒血清抗体的浓度。简言之，将50ml在PBS中稀释1:25的血清样品放入每个孔中。在37℃孵育30分钟并用PBS洗涤后，将抗猫IgG（Nordic Immunology Laboratories，Titburg，The Netherlands）添加到每个孔中。在37℃下孵育孔30分钟并用PBS洗涤后，用甘油覆盖载玻片，并在荧光显微镜下在400X下检查。阳性孔被认为是具有30-50%荧光细胞的孔。将阳性血清稀释两倍，直到获得阴性结果。抗体滴度对应于提供阳性结果的最后一次稀释。

使用抗猫IgM抗体（VMRD Inc.）代替抗猫IgG作为二级抗体，在不同的载玻片上重复上述所有步骤。每一次测试都包括阳性对照（FPL positive control, VMRD Inc.）和阴性对照（PBS alone）。

使用软件Statistica（Statsoft Inc., Tulsa, OK, USA）进行统计分析。使用Kaplan–Meyer方法设计生存曲线，使用Gean氏Wilcoxon检验计算各组间的差异。对照组和治疗动物的数据与独立样本的Student t检验进行比较，或者当正态性检验显示数据具有非正态分布时，与相应的Mann–Withney非参数U检验进行比较。将同一动物重复样本的数据与相依样本的Student t检验或相应的Wilcoxon非参数检验进行比较。

在施用rFeIFN后的一周内(从研究期开始后的第2天到第14天)，猫舍中爆发了猫泛白细胞减少症。在13/17只对照猫(76.5%)和17/23只治疗猫(73.9%)中记录了与FP一致的临床症状(呕吐、腹泻、厌食和超急性胃肠发作后猝死)。在有症状的猫中，10/13的对照组(76.9%)和14/17的治疗小猫(82.4%)死亡。对照组的存活率为41.2% (7/17)，治疗组的存活率为39.1% (9/23)。在临床症状出现的时间或存活率方面，两组之间没有显著差异(图1)。

图1.与猫泛白细胞减少症一致的症状出现时间(A)、存活时间(B)以及对照组和治疗组动物之间的统计比较结果。

尸检证实了所有9只受检猫的急性猫细小病毒病诊断。所有的猫都有涉及小肠(空肠和/或回肠)的坏死性和出血性肠炎。组织学特征是隐窝上皮的坏死程度不同。隐窝通常扩张，含有丰富的管腔细胞碎片，在某些区域，显示扁平的上皮内衬。在一些隐窝中，检测到上皮细胞发育不良。其他发现是淋巴结皮质和脾白髓中严重的淋巴耗竭。骨髓也是中度至重度的细胞缺乏。对照猫和治疗猫的淋巴器官和骨髓损伤的严重程度相似。

在疾病爆发期间从对照和治疗猫获得的个体数据(图2)证明，与那些死亡的猫相比，大多数在疾病爆发中存活的猫具有更高水平的γ-球蛋白、IgG和特异性抗FPV IgG。与对照组相比，治疗组猫的α1-球蛋白和AGP水平显著降低(表1)。

图2 .对照组(C)和rFeIFN治疗组(T)的猫泛白细胞减少症发作期间，AGP电泳和总特异性IgG和IgM记录的结果分布。白点:疫情中幸存的猫；黑点:在疫情期间死亡的猫。

在第32天收集的血样中，经治疗的猫具有显著更高水平的γ-球蛋白、IgG和抗FPV特异性IgG(表1)。在rFeIFN给药后32天取样的治疗猫中的相同参数显著高于在暴发期间取样的治疗猫(表1)。

本研究的目的是评估施用*猫IFN-ω对生活在以猫细小病毒感染的高流行率为特征的救援庇护所中的小猫的炎症和免疫的血清标记物的可能影响。据我们所知，这是第一个评估rFeIFN影响的“现场”研究。如同在猫科动物救援庇护所中的任何其他“现场”研究一样，这种类型的方法具有符合日常惯例的优点。然而，主要的缺陷是随之而来的缺乏标准化。事实上，在“现场研究”中，不可能确定初次感染和IFN给药之间的间隔时间。此外，一些猫没有被完全处理，因为它们在夜间或周末死亡，阻碍了“新鲜”血液或组织的收集。此外，在某些情况下，样本是溶血的，必须从研究中排除。

虽然FP爆发的日期无法精确计算，但rFeIFN管理是根据过去几年记录的平均爆发起始日期启动的。不出所料，疫情发生在开始给药后的一周。具体而言，在第2天记录了第一个临床症状和/或死亡，此时来自“治疗”组的小猫仍在接受rFeIFN。

rFeIFN的剂量与其他病毒性疾病的猫相同（Ishida et al., 2004）。我们的方案与应用于犬种的方案非常相似，其特征在于在将动物引入污染环境期间或在出现与疾病一致的临床症状后立即接种疫苗，然后施用rFeIFN（Uchino, 1995; Martin et al., 2002; Truyen et al., 2002）不幸的是，由于尸体状况不佳，不可能对所有死亡猫进行尸检，也不可能调查幸存者粪便中是否存在猫泛白细胞减少症病毒，或者对所有有症状的活猫进行白细胞计数。由于高温、死亡和样本采集的时间过长，导致材料采集不完整，因此无法在包括在内的所有猫身上证明FPV。然而，记录的临床体征与急性FP一致，尸检和组织学证实了9只猫的这一诊断。这些发现，加上我们对FPV生态学、流行病学和临床表现的了解，以及在感染急性期产生的特异性抗FPV IgM的发现，使我们能够得出结论，FP存在于猫体内，并可能影响所有猫。

与在犬中报道的相反，在该研究中，施用rFeIFN不影响临床症状的发展或疾病爆发期间的存活率(Minagawa et al., 1999; Martin et al., 2002; De Mari et al., 2003)。然而，对炎症/免疫间接标记物的血清水平的分析表明，rFeIFN影响炎症的发展和对FPV的免疫反应。

尽管研究中包括的动物数量与之前的实验室实验相当或更多（Martin et al., 2002; De Mari et al., 2003），但每组猫的总数太少，无法检测出有或没有临床症状的猫之间的统计显著差异。此外，由于生化数据的多种不同分析，I型统计误差（例如统计显著性的高估）可能会影响数据分析。尽管如此，在疫情期间收集的个体数据表明，两组猫中的总和抗FPV特异性IgG水平较高，且在采样时无症状，尤其是在感染后存活的情况下。这些数据支持Pollock和Carmichael（1982）的假设，即母体被动IgG转移可防止细小病毒，并使小猫产生适度的全身炎症反应，似乎可以保护它们免于恶化或死亡。相反，有症状的猫，包括一只在采样前2天接种疫苗的小猫，没有出现重大电泳变化（数据未显示），这可能是由于疾病的超急性过程。

有症状和无症状对照猫的AGP水平在先前研究中包括的对照猫报告的范围内（Kajikawa et al., 1999）。症状对照组中缺乏炎症变化可能是疾病超急性过程的结果，尽管在实验诱导的炎症中，AGP在24小时内增加（Kajikawa et al., 1999）。本研究中包括的大多数猫在出现临床症状后数小时内死亡，或者在某些情况下，发现它们处于濒死前或濒死状态，因此，可能在循环AGP可能增加之前死亡。治疗猫体内AGP和a-球蛋白（AGP和其他急性期蛋白迁移的电泳部分）的浓度低于对照组，这表明rFeIFN治疗抑制了所谓的“急性期反应”，很可能是通过其对负责全身炎症反应的“细胞因子网络”的影响。相反，rFeIFN给药并未引起γ球蛋白或总抗体和FPV特异性抗体类别的显著变化。然而，这并不令人惊讶，因为最后一次治疗和血液采样之间的间隔太短（3–8天），无法证明这些参数的变化。尽管如此，对个体数据的分析表明，与未治疗的猫相比，治疗组的大多数猫具有更高的IgM水平和更高的抗FPV IgM滴度，因此，尽管上述延迟很短，但治疗组的猫对FPV产生了早期IgM介导的免疫反应。本研究无法推断rFeIFN发挥这种作用的机制。然而，第32天获得的结果证实了rFeIFN刺激免疫系统反应的假设，当时治疗猫对疫苗试验的反应更强烈，与对照猫相比，γ球蛋白、总抗体和FPV特异性IgG的水平更高。

本研究的结果表明，在自发性猫泛白细胞减少症中，rFeIFN不具有典型的I型干扰素的抗病毒作用，这与体外和犬中报道的相反(Mochizuki et al., 1994; Truyen et al., 2002; Ishiwata et al., 1998; Minagawa et al., 1999; Martin et al., 2002; De Mari et al., 2003)。在治疗组和对照组小猫中，病毒传播导致相似的发病率和死亡率。然而，由于“现场”研究的限制，不可能得出rFeIFN在FPV没有免疫治疗作用的结论。相反，接受治疗的动物似乎具有更具反应性的免疫系统(如疫苗试验所示)和降低的急性炎症反应性。这种强有力的免疫调节活性表明，在将幼猫引入高风险环境前2周对幼猫进行rFeIFN治疗，随后进行疫苗接种，或在此之前对母猫进行治疗以改善被动母体免疫的转移，可以在幼猫暴露于病毒时为幼猫提供良好水平的IgG。在设计预防猫细小病毒爆发的预防方案时，应考虑这种免疫调节作用。

This work was supported by the University grant FIRST 2003. The authors are grateful to Drs. Alessia Giordano and Valentina Spagnolo for their assistance.

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