撰文 | 言笑
人类细胞间期的基因组折叠成拓扑关联结构域(topologically associating domains, TADs)。在第一代Hi-C和5C数据中,TADs被定义为超大规模的、自相互作用的染色质片段,其中DNA序列在区域内的接触频率大大高于区域间的接触频率【1-3】。过去十年中,分子和计算领域的进步实现了超高分辨率基因组折叠图谱的绘制,信噪比得到了显著改善。通过这些技术发现了A/B区室【4】,TADs中的嵌套subTADs【5】,指示长范围(long-range)环相互作用的点状结构【4】,以及指示环挤压的条带(stripe)【6】。根据详细的(fine-grained)结构特征对Hi-C图中的TADs/subTADs亚型进行分类是极具挑战性的。明确定义TADs/subTADs的结构类别,反过来将有助于仔细分析各个边界的分子组成、组织原则以及基因组功能范围内独特的因果关系。
DNA复制通过一系列错综复杂的分子事件发生,是基因组稳定性的基础。目前,尚不清楚复制起点(origin)的位置是如何在人类基因组中确定的。2022年6月8日,来自美国宾夕法尼亚大学的Jennifer E. Phillips-Cremins团队在Nature杂志上在线发表了题为Cohesin-mediated loop anchors confine the locations of human replication origins的文章。研究人员剖析了TADs、subTADs和环(loops)在复制起始区(initiation zones, IZs)定位中的作用,并提出了一个模型:黏连蛋白介导的环挤压(cohesin-mediated loop extrusion)及其在遗传编码的TAD和subTAD边界处的停顿是决定S期复制起点位置的重要因素。
作者开发了一种高分辨率Repli-seq方法,允许以50-kb分辨率鉴定基因组中IZs的位置。将不同阶段S期的IZs基因组位置与来自人类胚胎干细胞(H1)的高分辨率Hi-C数据进行比较:高效率early-S-phase IZs与一侧或两侧由corner-dot TADs/subTADs划分的强绝缘边界共定位(图1a);相反,在S期后期起始复制的低效率IZs与没有corner-dot的TADs/subTADs之间的边界共定位(图1a)。作者因此将边界分为三组:双点边界——两侧相邻的corner-dot TADs/subTADs;单点边界——仅一侧的corner-dot TADs/subTADs,另一侧无点;无点边界——两侧相邻的无点TADs/subTADs。由于双点和单点边界表现出相似的IZ定位模式,作者组合为点边界。Cohesin对TADs/subTADs的形成至关重要。作者观察到,与早期IZs重叠的点边界处的共同结合CTCF和cohesion位点的密度更高。与early-S-phase IZs共定位的边界表现出由CTCF和cohesin共结合motifs占用增加。
图1. 高效IZs特异性地定位于角点TAD/subTAD边界
最近的报告发现,聚合的CTCF motifs锚定了由cohesin-mediated loop extrusion形成的long-range loop相互作用。作者观察到,大多数点边界都由两个或多个CTCF cohesin-binding motifs构成,这些motif以聚合或发散方向排列(图1c)。当点边界与早期复制IZs共定位时,这个分子特征将会进一步强化。相反,几乎所有的无点边界仅包含一个或没有CTCF cohesion-bound motifs(图1c)。无点边界与晚期IZs共定位,通常被一个CTCF motif锚定(图1c)。因此,作者将点和无点边界进一步分层:复杂方向的具有CTCF cohesion-binding motifs(classes 1和4)、串联 单向motif(classes 2和5)、无结合motif(classes 3和6)(图1d)。
为了了解cohesin和TAD/subTAD结构完整性对S期中起点的定位是否是必要的,作者在cohesin亚基RAD21降解的HCT116细胞中检测了全基因组折叠破坏后的IZs。在野生型HCT116细胞中鉴定出与人类ES细胞相同的点和无点TADs/subTADs以及边界类别。敲低cohesin后,几乎所有的点和无点边界都被破坏了。作者在野生型和cohesin敲低HCT116细胞中获得了高分辨率16-fraction Repli-seq数据,以及单分子光学复制图谱(optical replication mapping, ORM)数据。16-fraction Repli-seq数据在野生型HCT116细胞中表现出高效/早期IZs在点边界的特异性富集,低效率、晚期IZs在弱无点边界处富集。通过分析单分子ORM数据,作者在class 1边界处检测到起点初始化的富集。消除cohesin介导的边界后,class 1边界处的高效early-S-phase IZs受到严重破坏。在cohesin敲低后,位于无点边界处的低效率IZs在S期末转向复制。
如果cohesin无法卸载,G1期中停留在复杂CTCF边界上的cohesin分子将会增加,进而产生新的long-range loops,可能会使S期高效起点数量增加或它们的基因组位置变窄。作者在G1期WAPL降解的HCT116细胞中通过16-fraction Repli-seq检测了S期IZs的基因组位置。WAPL敲低后的gain-of-looping表型显著性地发生在具有复杂方向的CTCF motif点边界处。在class 1边界,WAPL敲低之后早期IZs变窄。在WAPL敲低的条件下,IZs的收紧和优化都发生在相同的边界处。这些实验结果进一步支持一个模型:间期中的cohesin-mediated loop extrusion可以确定性地告知S期中活化起点的位置。
最后,作者试图了解特定的边界是否是调节IZ firing的充要条件。作者在基因组中删除了80-kb,该部分包含超过10个复杂取向的CTCF cohesion-binding位点,锚定了一个long-range染色质环,该环将晚期复制定时域与早期复制时间域分开。删除80-kb后,从早期到晚期复制时间发生局部延迟,表明在特定的早期 IZ的复制可以在边界消除后转移至S期后期。随后,作者引入了异位边界,发现在异位边界处晚期复制转变为早期复制,表明引入异位边界足以诱导复制起始的变化。
了解人类基因组的结构-功能关系仍然是人类遗传学家和染色质生物学家面临的主要挑战。该研究通过表示loop的角点和CTCF基序的方向对TADs和subTADs进行分层,确定了TADs/subTADs的不同结构类别与DNA复制之间的功能*(1)高效率的早期复制IZs定位在相邻corner-dot TADs之间的边界;相反,低效率IZs定位在较弱的无点边界。(2)在G1期消除cohesin-mediated loop extrusion将扰乱高效率IZs定位;敲低WAPL后,将会在相同边界上获得long-range loop并缩小IZs定位;删除或插入特定边界会导致局部复制时间偏移。
DNA复制的启动涉及两个相互排斥的步骤。第一步,获得起点许可,开始于细胞分裂末期,加载两个拷贝的迷你染色体维持复合物(MCM2-7)。MCM2-7最初以非活性形式在人类基因组的数万个位点过量加载,作为双六聚体,环绕双链DNA。第二步,起点的激活,发生在S期开始时。起点激活涉及的机制既能阻止MCM的进一步加载,又能招募多个额外的因子来启动双螺旋的解旋和 DNA 合成。在哺乳动物系统中,如何控制和选择MCM-bound、licensed origins子集,使其在S期激活,仍然是一个谜团。该研究提出了一个模型,由复杂方向CTCF cohesion-binding位点标记的点边界上的cohesin-mediated loop extrusion和停留是高效复制起点定位所必需的(图2)。
图2. DNA复制起始模型
原文链接:
https://doi.org/10.1038/s41586-022-04803-0
制版人:十一
参考文献
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