背景介绍
人体几乎所有细胞均可产生外泌体，且外泌体基于其内源性、生物相容性和多功能特性，可参与机体免疫调节、血管新生、细胞增殖及凋亡等环节，使其应用广泛。但目前大规模、低成本制备外泌体仍是行业难点[1]，科研工作者及商业化公司在不断改进外泌体制备工艺，提高外泌体产量[1-2]。本文将介绍使用同腾新创（苏州）科技有限公司自主研发CEL-G® Culture Ad60系列固定床生物反应器（Ad60 FBR）通过提高培养基线速度提高外泌体产量的培养工艺。
文献中[3]提到使用3D打印灌流生物反应器培养骨髓来源间充质干细胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BM-MSCs），通过提高灌流培养模式灌流速度增加切向力的方式提高细胞外囊泡（Extracellular vesicles ，EVs）产量，通常细胞外囊泡特指外泌体（Exosomes）。并对不同灌流速度下外泌体产量做了检测对比，从而确定产量最高的灌流速度（图1. BM-MSCs在灌流反应器5ml/min灌流流速下取得最高外泌体产量），在5ml/min流速下显著提高外泌体产量且未将反应器内细胞冲洗下来。
图1. BM-MSCs在灌流反应器5ml/min灌流流速下取得最高外泌体产量
有趣的是，HEK293细胞内发现同样的趋势。在相同的培养条件下，随着流速提高外泌体产量明显提高，单个外泌体蛋白含量降低（图2. HEK293使用灌流反应器EV产量提高）。
图2. HEK293使用灌流反应器EV产量提高
CEL-G® Culture Ad60反应器（Ad60 FBR）上线速度对外泌体产量影响的研究
1) 概念验证
使用Ad60 FBR，2平米膜包和罐体，HEK293T使用相同培养基、相同细胞接种密度（2.4E4 cells/cm2），分别转速设置为300rpm提供0.5cm/s线速度，500rpm提供2cm/s线速度，批次模式培养进行概念验证。纳米颗粒分析（NTA）检测结果显示，线速度从0.5cm/s提高至2cm/s，外泌体产量增加2-4倍（图3. 批次模式不同线速度培养上清NTA检测结果）。
图3. 不同线速度培养上清NTA检测结果
2) 确认实验
使用Ad60 FBR，1平米膜包和2平米罐体，HEK293T使用相同培养基、相同细胞接种密度（0.5E4/cm2），分别转速设置为350rpm提供0.5cm/s线速度，550rpm转速提供2cm/s线速度，循环模式培养5天第一次收获上清，后续每隔48h收获一次上清，验证提高线速度可以增加外泌体产量（图4. 循环模式不同线速度培养上清NTA检测结果）。上清NTA检测结果显示：外泌体产量提高2-10倍，随着培养时间延长，外泌体产量提高趋势更加明显。
图4. 循环模式不同线速度培养上清NTA检测结果
结果讨论
结合文献灌流培养模式实验数据及同腾新创CEL-G® Culture Ad60固定床生物反应器（Ad60 FBR）两次测试数据（图3、图4），提高培养时罐内培养基线速度可显著提高细胞外泌体产量，此结果对大规模细胞培养提高外泌体产量有借鉴意义。
参考文献：
[1] Jakl, Viktoria et al. “A novel approach for large-scale manufacturing of small extracellular vesicles from bone marrow-derived mesenchymal stromal cells using a hollow fiber bioreactor.” Frontiers in bioengineering and biotechnology vol. 11 1107055. 24 Jan. 2023, doi:10.3389/fbioe.2023.1107055
[2] Kink, John A et al. “Large-scale bioreactor production of extracellular vesicles from mesenchymal stromal cells for treatment of acute radiation syndrome.” Stem cell research & therapy vol. 15,1 72. 13 Mar. 2024, doi:10.1186/s13287-024-03688-2
[3] Kronstadt, Stephanie M et al. “Mesenchymal Stem Cell Culture within Perfusion Bioreactors Incorporating 3D-Printed Scaffolds Enables Improved Extracellular Vesicle Yield with Preserved Bioactivity.” Advanced healthcare materials vol. 12,20 (2023): e2300584. doi:10.1002/adhm.20230058
