一、如何判断我的质粒是高拷贝还是低拷贝质粒？
高拷贝质粒每 1 ml LB 培养物应产生 3-5 ug DNA，而低拷贝质粒每毫升 LB 培养物应产生 0.2-1 ug DNA。
DNA构建体 | 复制的起源 | 拷贝数 | 分类 |
pUC vectors | pMB1* | 500–700 | high copy |
pBluescript® vectors | ColE1 | 300–500 | high copy |
pGEM® vectors | pMB1* | 300–400 | high copy |
pTZ vectors | pMB1* | >1000 | high copy |
pBR322 and derivatives | pMB1* | 15–20 | low copy |
pACYC and derivatives | p15A | 44481 | low copy |
pSC101 and derivatives | pSC101 | ~5 | Very low copy |
SuperCos | pMB1* | 44489 | low copy |
pWE15 | ColE1 | 44489 | low copy |
二、未提出质粒或者 质粒得率较低
可能原因 | 建议解决方案 |
大肠杆菌老化 | 请重新涂平板，新挑取单个克隆菌落进行液体培养，如果需要放大到 100 ml 之上的体积，建议先进行小规模培养，逐步放大。 |
质粒拷贝数偏低 | 低拷贝质粒或者一些大片段长度的质粒可能由于复制速度降低引起质粒 DNA 提取量低，请参考说明书中低拷贝质粒提取方法进行操作。 |
菌体中无质粒 | 有些质粒可能不能在某些菌种中稳定存在。建议转接时接种单菌落。避免频繁转接。也可能由于培养环境丧失了选择压力而造成质粒丢失。请检查抗生素有效期或者浓度是否合适。 |
裂解不够充分 / 菌体使用量；超过试剂盒最大规定负载 | 裂解时用 lyseblue 监查裂解是否充分。请按照说明书规定的菌体湿重操作，并且注意高拷贝和低拷贝质粒的菌体用量和裂解液用量。 |
超过说明书建议菌体用量，导致树脂柱或硅胶膜柱超载 | 如果有大量的菌体样本，请分批多次提取。如果使用富养培养基例如 TB 或者 2×YT，需要相应减少培养体积。对于高拷贝质粒，也要相应调节 LB 培养的体积。 |
洗脱液不合适 | 硅胶膜纯化方法（请参见本册页检查你使用的产品属于何种技术）获得的质粒 DNA 在低盐溶液条件中才能洗脱，例如 Buffer EB（10 mM Tris Cl、pH 8.5）或者水（7.0< pH<8.5）。 |
洗脱体积太小，或者洗脱液在膜上分布不均匀 | 适当增加洗脱体积（例如增加 20% - 50%），注意令洗脱液在硅胶膜 上分布均匀。 |
裂解时间过长 | 加入裂解液 P2 之后孵育时间不能超过 5 分钟，请使用计时器帮助限制时间。 |
三、质粒纯度影响下游操作的效果
可能原因 | 建议解决方案 |
含有基因组 DNA 污染 | 加入 P2 和 P3，之后的混悬步骤动作要轻柔。 |
有 RNA 污染 | RNase A 的孵育不够。检查加入 RNase A 的 P1 溶液的保存条件和时间，如果 P1 中加入 RNase A 且保存时间超过 6 个月，请重复添加RNase A。 |
核酸酶污染 | 消毒，注意操作时使用新鲜器皿并且带手套。 |
蛋白残留 | 避免菌体超量，或者可以重复 P1-P2-P3 之后的沉淀步骤一次。 |
盐含量过高 | 树脂柱子提纯质粒时，使用异丙醇沉淀的步骤在室温下进行。并且建议在室温下用 70% 乙醇洗涤沉淀。建议重复乙醇沉淀步骤，可以更彻底去除盐分。 |
乙醇残留 | 使用硅胶膜方法提取质粒时，在离心弃去 PE 溶液之后再进行一次一分钟高速离心，以完全去除乙醇，之后在室温下放置 1 分钟再进行最后的洗脱步骤。 |
