顺治九年，明永历六年（1652年）三月，李定国在军事上已经做好准备，便向孙可望建议对清军发动一次大反攻。孙可望命冯双礼领兵合同李定国组成东路军，以八万人马攻湖南；命刘文秀和王复臣组成的北路军，以六万人马攻四川。
北路军进展顺利，当年七月收复叙州和重庆，活捉清军将领白含贞、白广生，并将主将平西王吴三桂围困在保守，十月，吴三桂突围到汉中，王复臣战死，但四川大部地区已经收复。
东路军同样也获得了重大胜利。五月，攻克了沅州、靖州，清军总兵杨国勋被*，主将沈永忠退守湘潭。此时，李定国驻扎在靖州以东的武岗，当他了解到桂林防务空虚后，便带兵南下，兵分三路：右路攻取桂林以北的重镇严关，左路攻全州，他自己亲率中路直取桂林。
拿下全州后，李定国集中优势兵力，一鼓而下桂林。三路大军在严关会和后，即对清军展开猛烈攻击。双方正难分难解的时候，李定国命大象兵参战。当时正遇雷雨天，这些庞然大物在雷鸣电闪中一冲而上，搅得敌阵大乱，清军横尸遍野，狼狈溃逃。
李定国乘热打铁，昼夜围攻桂林，清军主将、定南王孔有德被迫自*，七月初四日攻克桂林。接着，李定国又连下柳州、梧州、永州、衢州，直抵长沙。
李定国的节节胜利，使清廷大为震惊。十月，清廷派皇族宗室敬谨亲王尼堪率十万大军扑向长沙。李定国冷静分析双方的形势，决定撤出长沙，退守衡阳。在衡阳城下，双方展开了激烈的战斗，四天四夜不分胜负。李定国使出了大西军惯用的战术，命令部队边打边退，直把清军引进埋伏圈。清军中计，被层层包围，溃不成军，尼堪被阵*，清军全军覆没。
在不到一年的时间里，李定国歼灭了十余万敌军，*死了两名清军的王爵将领。桂林、衡阳的两次胜利，是南明抗清以来获得的最大胜利，也开启了抗清的新局面。
矢志不移、病死疆场桂林、衡阳的胜利带来的大好形势，不久即被孙可望所破坏。李定国的战功，使孙可望大为嫉妒，在部将的怂恿下，他决定亲自到前线，想打个漂亮仗来提高声望。
孙可望到了湖南，派人让李定国到沅州见他，当时有消息说，孙可望想把李定国扣留起来。为了避免与孙可望发生冲突，李定国将大部分兵力留在湖南，自己率领部分兵马到两广一代继续和清军作战。
顺治十年（1653年），李定国进攻肇庆和桂林失手，就采取逐步发展的打法。他先攻打两广交界地区的一些小州县，然后积蓄力量围攻广州。清军镇守广州的主将是明朝降将、平南王尚可喜和靖南王耿继茂。后来，清军又从南京调兵支援，兵力占了优势。这年十二月，李定国与清军在新会附近接火，李定国部遭到夹击。为保存实力，退回南宁。
顺治十二年五月，刘文秀率六万军队，从四川出三峡，进攻湖南常德，在兵分两路攻打岳阳和武昌，但都没有成功，只得退守贵阳。
几次战事失利，西南地区的抗清形势不断恶化。顺治十三年，李定国护卫永历帝前往昆明，因护驾有功，被封为晋王。而这时的孙可望野心越来越大，一心想要除掉李定国。为了停止分裂，李定国、刘文秀派人到贵阳进行劝说，并于顺治十四年，将孙可望留在昆明的家小送到贵阳。但孙可望并不领情，反而以十四万大军*向云南。
八月，双方在交水决战，孙可望各营将士倒戈，高呼欢迎晋王，孙可望一败涂地，逃回贵阳，贵阳守军不纳，乃率十几人投降清军，向清军提供了大西军的全部机密和云、贵山川的形势。
顺治十五年（1658年），清军从四川、云南、广西派出三路大军，一起压向贵州和云南。重庆、贵阳、遵义相继失守。尔后，清军兵分三路进攻云南。北路的吴三桂从四川南下；南路的卓布泰从广西西进；中路的洪承畴从湖南攻入贵州。吴三桂进入云南后，永历帝在李定国的保护下，从昆明向西撤退。
顺治十六年（1659年），清军占领昆明后继续追击。李定国集结溃散的将士，选出六千精兵，在怒江以西二十里的磨盘山的狭路上设置了三道伏兵，准备首尾夹击。本来吴三桂已经进入埋伏圈，可这时李定国的部将卢桂生叛变，设伏失败。计划虽然没有实现，它却给清军以沉重一击，十余名都统以下的将领和几千精兵被歼灭。
磨盘山之役后，永历帝逃入缅甸，和李定国失去联系。李定国一面在滇缅边境继续坚持抗清，一面派人到缅甸境内寻找永历帝。这时，边境条件非常艰苦，很多部属先后降清，但李定国的抗清意志始终没有动摇。
顺治十八年（1661年），吴三桂统率十万大军开进缅甸。康熙元年（1662年）二月，缅王将永历帝及其亲属交给了吴三桂。四月，永历帝在昆明被吴三桂所*，南明王朝至此灭亡。
李定国得知永历帝被*的消息时，还在四处转战，但由于积劳成疾，病情日益恶化，这一年六月病逝。临死前，他对部下说：宁可死在荒凉的边地，绝不可投降。他的忠义节烈直到近代仍被人称赞不绝，章炳麟曾说：“愿吾滇人，毋忘李定国！”
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