3.Primer Pair Specificity Checking Parameters验证引物的特异性,选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。这里提供了6种数据库:RefSeq mRNA, Refseq representative genomes,nr,RefseqRNA(refseq_rna),Genomes for selected organism, Custom。推荐使用“Refseq representative genomes”数据库,Custom可以使用自己的序列作为搜索数据库。
用NCBI的参考序列作为模板和参考序列数据库作为标准来设计引物时,Primer-BLAST可设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物。跟其它的BLAST一样,点击底部的“Advanced parameters”有更多参数设置,但一般不用再增加参数设置了。
4.单击Get primers,有时可能需要耐心等待一会,
出现结果界面,下图是引物的可视化结果,该结果会显示出所有引物的起始和终止位置,基因的CDS区,外显子的位置等。