百欧博伟生物：本文介绍几种常见的微生物基础试验的目的、原理、内容等，以便刚刚接触微生物的同志们对试验有个基本的认识。
实验一 常用培养基的制备、灭菌与消毒
一、实验目的
1、掌握配制培养基的一般方法和步骤;掌握干热天菌、高压蒸汽灭菌及过滤除菌的操作方法。
2、了解培养基的配制原理;了解常见灭菌、清毒基本原理及方法。
二、实验原理
培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物.培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水.根据微生物的种类和实验目的不同,培养基也有不同的种类和配制方法。
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基,有时又称为普通培养基.由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质,所以可供微生物生长繁殖之用。
干热天菌、高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到*死微生物的效果。
三、试剂与器材
1、器材 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。
2、试剂 牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂。
四、实验内容
1、称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查
2、干热灭菌:装入待灭菌物品→升温→恒温摇床→降温→开箱取物
3、高压蒸汽灭菌:加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒压→降压回零→排汽→取物→无菌检查
4、过滤除菌:组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌
五、关键步骤及注意事项
1、要严格按配方配制。
2、调pH不要过头。
3、干热灭菌要注意物品不要堆放过紧,注意温度的时间控制,70oC以下放物、取物。
4、高压灭菌要注意物品不要过多,加热后排除冷空气,到时降压回零取物。
5、过滤除菌要注意各部件灭菌,压滤时,压力要适当,不可太猛太快,滤膜要注意清洗保存。
六、思考题
1、培养基配好后,为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？
2、在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?为什么？
3、培养微生物的培养基应具备哪些条件?为什么？
4、培养基的配制原则是什么？
实验二 土壤中微生物分离纯化培养
一、实验目的
1、掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术;掌握微生物培养方法。
2、了解不同的微生物菌落在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征;进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术。
二、实验原理
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化.
常用的分离、纯化方法:单细胞挑取法,稀释涂布平板法,稀释混合平板法,平板划线法.
稀释涂布平板法步骤:倒平板－制备土壤污水稀释液－涂布－培养－挑菌落.
平板划线法步骤:倒平板－标记培养基名称－划线.
三、试剂与器材
1、器材 盛9ml无菌水的试管、盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、酒精灯、无菌培养皿、显微镜、血细胞计数板等。
2、试剂 牛肉膏蛋白胨培养基,高氏1号培养基,查氏培养基
四、实验内容
1、土壤稀释液的制备
2、微生物分离纯化:稀释涂平板法,平皿划线分离法,微生物培养技术
五、关键步骤及注意事项
1、掌握含菌培养基的配制,严格控制温度.
2、平板划线应防止染菌,同时应注意划线深度及密度.
六、思考题
1、如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤.
2、如果要分离得到极端嗜盐细菌,在什么地方取样品为宜？并说明理由.
实验三 菌种保藏
一、实验目的
1、学习并掌握菌种保藏的基本原理.
2、掌握常用的几种不同的菌种保藏方法.
二、实验原理
微生物个体微小、代谢旺盛、生长繁殖快,如果保存不妥容易发生变异和杂菌污染,甚至导致细胞死亡等现象.因此,保存好菌种是非常必要和重要的.常用的菌种保藏方法包括传代培养法、载体法、悬液法、冷冻法和真空干燥法。
三、试剂与器材
1、材料 大肠杆菌、青霉菌、放线菌
2、试剂 液体石蜡、甘油、五氧化二磷、95％乙醇、10％盐酸、无水氯化钙、食盐、干冰
3、器材 无菌吸管、无菌滴管、无菌培养皿;安额管、冻干管、40目与100目筛子、油纸、滤纸条(0.5X1、2cm)、干燥器、真泵器、真空泵、真空压力表、喷灯、L形五通管、冰箱、低温冰箱(—30℃)、超低温冰箱和液氮罐等。
四、实验内容
1、斜面保藏法
2、液体石蜡法
3、穿刺保藏法
4、砂土管保藏法
5、冷冻真空干燥保存法
五、关键步骤及注意事项
1、清楚各种保藏方法的优缺点,针对不同要求选择适宜的保藏方法.
2、熔封安瓶时防止封闭不严.
3、液氮冻存操作应防止冻伤.
六、思考题
根据你自己的实验谈谈1--2种菌种保藏方法的利弊？
实验四 细菌形态观察及单染色
一、实验目的
1、了解简单染色法的原理,并掌握其操作方法.
2、学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术.
3、巩固显微镜(油镜)的使用方法.
4、初步认识细菌的形态特征.
二、实验原理
细菌个体微小,且较透明,必须借助染色法使菌体着色,与背景形成鲜明的对比,以便在显微镜下进行观察.根据实验目的不同,可分为简单染色法、鉴别染色法和特殊染色法等.简单染色法是最基本的染色方法,是利用单一染料对细菌进行染色.此法操作简便,适用于菌体一般形状和细菌排列的观察.常用碱性染料进行简单染色。
三、试剂与器材
1、材料 大肠杆菌,枯草芽孢杆菌
2、试剂 吕氏碱性美蓝染液(或草酸铵结晶紫染液)、齐氏石炭酸复红染液.
3、器材 显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶(内装香柏油和二甲苯)等.
四、实验内容
简单染色法:涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检
五、关键步骤及注意事项
1、涂片时,生理盐水及取菌不宜过多,涂片应尽可能均匀,
2、水洗步骤水流不宜过大,过急,以免涂片薄膜脱落.
六、思考题
1、你认为制备细菌染色标本时,尤其应该注意哪些环币?
2、为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察?
3、如果你的涂片未经热固定,将会出现什么问题?如果加热温度过高。
实验五 放线菌及霉菌形态观察
一、实验目的
1、了解放线菌、霉菌形态观察的原理;
2、学习并掌握观察放线菌、霉菌形态的操作方法;
3、初步了解放线菌、霉菌的形态特征.
二、实验原理
放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌.常见放线菌大多能形成菌丝体,紧贴培养基表面或深入培养基内生长的叫基内菌丝(简称“基丝”),基丝生长到一定阶段还能向空气中生长出气生菌丝(简称“气丝”),并进一步分化产生孢子丝及孢子.有的放线菌只产生基丝而无气丝.在显微镜下直接观察时,气丝在上层、基丝在下层,气丝色暗,基丝较透明.孢子丝依种类的不同,有直、波曲、各种螺旋形或轮生。
霉菌可产生复合分枝的菌丝体,分基内菌丝和气生菌丝,气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝,由繁殖菌丝产生孢子.霉菌菌丝体(尤其是繁殖菌丝) 及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据.霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多,常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍,因此,用低倍显微镜即可观察.人们设计了各种培养和观察方法,这些方法的主要目的是为了尽可能保持放线菌自然生长状态下的形态特征.本实验采用插片法。
插片法：将放线菌接种在琼脂平板上,插上灭菌盖玻片后培养,使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻上.观察时,轻轻取出盖玻片,置于载玻片上直接镜检.这种方法可观察到放线菌自然生长状态下的特征,而且便于观察不同生长期的形态。
三、试剂与器材
1、材料 黑曲霉、青霉和根霉,细黄链霉菌或青色链霉菌,灭菌的高氏I号琼脂和灭菌的查氏培养基。
2、实验器材 经灭菌的:平皿、玻璃纸、无菌吸管、盖玻片、玻璃涂棒,以及载玻片、接种环、接种铲、镊子、显微镜等。
四、实验内容
倒平板→接种→插片→培养→镜检
五、关键步骤及注意事项
1、倒平板要厚一些,接种时划线要密.
2、插片时要有一定角度并与划线垂直.
3、观察时,宜用略暗光线;先用低倍镜找到适当视野,更换高倍镜观察.
4、如果用0、1%美蓝对培养后的盖玻片进行染色后观察,效果会更好.
六、思考题
1、镜检时,你如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝？
2、你认为霉菌和放线菌菌丝的主要区别是什么？
实验六 革兰氏染色及芽孢染色
一、实验目的
1、了解革兰氏染色法和芽孢染色法的原理,并掌握其操作方法;
2、了解革兰氏染色法在细菌分类鉴定中的重要性;
3、学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术;
4、学习显微镜(油镜)的使用方法;
5、初步认识细菌的形态特征.
二、实验原理
革兰氏染色法的基本步骤是:先用初染剂结晶紫进行染色,再用碘液媒染,然后用乙醇(或丙酮)脱色,最后用复染剂(如番红)复染.经此方法染色后,细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌;如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色),该菌属于革兰氏阴性菌.革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征,为保证染色结果的正确性,采用规范的染色方法是十分必要的.芽孢染色法的基本原理,用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红,在加热条件下染色,使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内,进入菌体的染料经水洗后被脱色,而芽孢一经着色难以被水洗脱,当用对比度大的复染剂染色后,芽孢仍保留初染剂的颜色,而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色,使芽孢和菌体更易于区分。
三、试剂与器材
1、材料:枯草芽孢杆菌12～18h营养琼脂斜面培养物,大肠杆菌约24h营养琼脂斜面培养物
2、试剂 革兰氏染色液(结晶紫液、碘液、95％乙醇、番红液).5％孔雀绿水溶液
3、实验器材 小试管、滴管、烧杯、试管架、滤纸、木夹子、载玻片、盖玻片、凹载玻片、无菌水、显微镜等、接种环、双层瓶(内装香柏油和二甲苯)、擦镜纸、生理盐水等.
四、实验内容
1、革兰氏染色法 制片→初染→媒染→脱色→复染→镜检.
2、Schaefer-Fulton氏染色法 制片→染色→水洗→复染→水洗→镜检.
五、关键步骤及注意事项
1、涂片时,生理盐水及取菌不宜过多,涂片应尽可能均匀。
2、乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节,严格掌握脱色时间。
六、思考题
1、你认为要得到正确的改良的革兰氏染色结果必须注意哪些操作？关键在哪一步？为什么？
2、现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌,请你鉴定其革兰氏染色反应.你怎样运用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色,以证明你的染色结果正确性。
3、你的染色结果是否正确？如果不正确,请说明原因。
4、若涂片中观察到的只是大量游离芽孢,很少看到芽孢囊及营养细胞,你认为这是什么原因？
5、说明芽孢染色法的原理.用简单染色法能否观察到细菌的芽孢？
实验七 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴定
一、实验目的
1、观察酵母菌的形态特征、出芽生殖方式,并掌握酵母菌与细菌形态特征的区别。
2、学习鉴别死活细胞的实验方法。
二、实验原理
酵母菌是单细胞的真核微生物,菌体比细菌大而且不运动.酵母菌的繁殖方式分为无性繁殖和有性繁殖两种,以无性繁殖为主.芽殖是酵母菌普遍的无性繁殖方式,少数为裂殖;有性繁殖是产生子囊和子囊孢子.本实验是通过美蓝染液水浸片和水一碘液水浸片来观察酵母的形态和芽殖方式。
美蓝是一种无毒性的染料,它的氧化型呈蓝色,还原型无色.用美蓝对酵母活细胞染色时,由于细胞的新陈代谢作用,细胞内具有较强的还原能力,能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型,而对代谢作用微弱或死细胞,无此还原能力或还原能力极弱,而被美蓝染成蓝色或淡蓝色.因此,不仅用此法可观察酵母细胞形态,也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。
三、试剂与器材
1、材料 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或卡尔酵母(Saccharomyces calsbergensis)培养2天左右的麦芽汁(或豆芽汁)液体培养物。
2、试剂 0.05％和O.1％吕氏碱性美蓝染色液、革兰氏染色用的碘液。
3、器材 显微镜、载玻片、盖玻片、接种环、洒精灯等。
四、实验内容
1、美蓝浸片观察 酵母培养→制片→染色→镜检→30分钟后再镜检
2、水-碘浸片观察
五、关键步骤及注意事项
1、染液不宜过多或过少,否则,在盖上盖玻片时,菌液溢出或出现大量气泡。
2、用镊子取一块盖玻片,先将一侧与菌液接触,然后慢慢将盖玻片放下,使其盖在菌液上,盖玻片不宜平着放下,避免气泡产生。
六、思考题
1、吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同,对酵母菌死细胞数量有何影响？试分析其原因.
2、在显微镜下,酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌？
实验八 微生物直接计数法及测微技术
一、实验目的
1、了解血球计数板计数原理,并掌握计数方法。
2、掌握用测微尺测定微生物大小的方法。
二、实验原理
显微镜直接计数法是将一定稀释的菌体或孢子悬液注入血球计数板的计数室中,于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法.因为计数板是一块特别的载玻片.其上由四条槽构成三个平台;中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半,每一边的平台上各刻有一个方格网,每个方格网共分为九个大方格,一种是一个大方格分成25个中方格,而每个中方格又分成16个小方格(见图2—3—44);另一种是一个大方格分成16个中方格,每个中方格又分成25个小方格,无论哪种每个大方格中的小方格都是400个.每一个大方格边长为0.1mm,所以计数室的容积为0.1mm³.计数时,通常只用5个中格内的菌体(孢子)数即可.然后求出每个中方格的平均值,再乘上25或16,得出一个大方格中的总茵数,再换算成lml菌液中的总菌数.若设5个中方格中总菌数为N,菌液稀释倍数为M,如果是25个中方格计数板,则计算方法为：
lml菌液中的总菌数=平均每个中格中菌的个数×25×104×M=50000N•M(个)
微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征,也是分类鉴定的依据之一.微生物大小的测定,需要在显微镜下,借助于特殊的测量工具——测微尺,包括目镜测微尺和镜台测微尺.镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片,一般是将1mm等分为100格,每格长0.01mm(即10pm).镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小,而是用于校正目镜测微尺每格的相对长度。
三、试剂与器材
1、材料 酿酒酵母、藤黄微球菌和大肠杆菌的染色标本片、酿酒酵母24h马铃薯斜面培养物。
2、实验器材 细胞计数板、显微镜、盖玻片、无菌毛细滴管、目镜测微尺、镜台测微尺、载玻片、盖玻片、显微镜等。
四、实验内容
1、微生物直接计数法 菌悬液制备→镜检计数室→加样品→显微镜计数→清洗血细胞计数板
2、微生物测微技术 装目镜测微尺→校正→菌体大小测定
五、关键步骤及注意事项
1、防止加样空气泡产生。
2、调节显微镜光线的强弱适当。
六、思考题
1、根据你的体会,说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差、力求准确？
2、某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率,请设计1～2种可行的检测方法。
3、为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时,必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？
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