在过去的几十年里，体外培养昆虫细胞出现了显著的增长。截至目前，已经报道了超过600种双翅目、半翅目和鳞翅目昆虫的细胞系。昆虫细胞培养除了广泛应用于*蛋白外，也越来越多地用作遗传学、分子生物学、生物化学和病毒学基础研究的工具。昆虫细胞培养自1956年首次应用于植物病毒研究以来，已成为研究植物病毒与昆虫载体之间复杂而密切的相互作用中不可或缺的工具。近年来，随着杆状病毒表达载体系统开始流行，在虫媒病毒和杆状病毒研究中对昆虫细胞系的开发重新引起了人们的兴趣，并为开发、传播经济上重要的植物病毒的媒介——昆虫的细胞培养物带来了技术机会。已有研究报道了叶蝉、飞虱、蚜虫、蓟马和白蝇组织的原代细胞培养和连续细胞系，为研究植物病毒与昆虫宿主因子间的相互作用提供了基础支撑。
▲我司Sf9细胞正常生长状态图
一、昆虫细胞培养史
昆虫细胞的体外培养最早记录于1915年，戈尔德施密特培养飞蛾的精子细胞。随后研究人员开始尝试和培养具有不同兴趣的昆虫细胞，但是遇到了困难，不同细胞在生长、存活的各个发育阶段都有所不同。在昆虫细胞培养研究的早期阶段，主要的挑战是制备模仿昆虫血淋巴的培养基，但这些培养物通常不能维持超过几天。1956年，Wyatt试图开发一种基于家蚕血淋巴组成的培养基。该培养基由含有一定比例的血淋巴的合成生理溶液组成。在Wyatt的培养基中，细胞退化的速度低于之前测试的任何培养基。随后，Grace进行了许多修改测试，以改善培养基的生长。直到1962年，Grace通过添加10种维生素来改良Wyatt培养基，并可以在实验室中长期保存，至此，才成功建立了首个连续昆虫细胞系。此后昆虫细胞培养在世界范围内广泛开展，研究人员根据目标组织的要求对培养基进行改良，不断有新的细胞系建立的报道。到2010年，已经开发出了大约100种不同昆虫的600种细胞系，其中，Sf9、Sf21和High Five是目前研究中最常用的昆虫商业细胞系。目前，昆虫细胞培养已在细胞生物学、分子生物学、昆虫学、病毒学、生物化学、遗传学等领域的研究工作中发挥着重要的作用。
二、影响昆虫细胞培养成功的因素
01培养基的组成在体外细胞培养中起着关键作用
细胞培养基为昆虫细胞的生长、增殖、分化提供了重要保障。昆虫细胞培养基的发展经历了天然培养基、合成培养基和无血清培养基三个阶段。虽然目前已有商品化昆虫培养基（Grace培养基、IPL-41培养基和TC-100培养基等），但是现有的培养基并不能适用于任何细胞系，不同的昆虫细胞系可能在其中一个培养基中生长较好，或这样培养的细胞对病毒的感染较为敏感。目前还没有并且尚未开发出用于培养所有不同来源的昆虫细胞所需的培养基，这也正是目前昆虫细胞培养的一个痛点和难点。
商品化培养基的基本组成是相似的，只是成分、浓度和一些补充化合物的添加比例不同，若现有商品化的培养基不适用于你目前研究的昆虫细胞，伯小医建议对培养基的以下成分进行调整和优化。
①糖类是大部分昆虫细胞主要的碳源和能源物质，主要是葡萄糖、果糖或麦芽糖，蔗糖也可以，但它在培养基中更主要的作用是调节渗透压；
②维生素是维持细胞生长的一类重要生物活性物质，对促进昆虫细胞生长和黏附具有积极作用；
③不同种类的昆虫细胞对氨基酸的需求是不一样的，其中有14种氨基酸是细胞本身不能合成，只能由培养基提供；
④谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质的重要材料，几乎所有的昆虫细胞对谷氨酰胺都有较高的要求，且会优先从培养基中摄取；
⑤培养的昆虫细胞更倾向于与体内等效的pH，以获得最佳生长，在大多数培养基中，pH范围为6.0~6.4是昆虫细胞生长的最佳条件。培养基的pH值可以通过添加盐酸或氢氧化钠来调节；
⑥其他因子，如异己酸、核黄素、胆碱和烟酰胺等，可促进昆虫细胞的存活和增殖。
02二氧化碳
在哺乳动物细胞培养中，外源二氧化碳通过二氧化碳-碳酸氢盐缓冲液维持最佳pH。但昆虫细胞在体外的生长并不需要二氧化碳，因为大多数培养基都是基于磷酸盐缓冲液。
03氧气
除了二氧化碳外，氧气的可利用性也会影响昆虫细胞的生存和生长。当溶解氧张力低于10%，就增加了乳酸沉积，并对几种昆虫细胞的生长产生了不利影响。在10%和30%的溶解氧张力之间，昆虫细胞的生长速率、浓度和氨基酸消耗量没有显著差异。
04温度
细胞培养的最佳温度在很大程度上取决于体内条件，即细胞被分离出来的宿主的体温。大多数哺乳动物细胞在36-37°C下生长良好，而27°C左右的温度是昆虫细胞生长的最佳温度。昆虫细胞在较低的温度下生长速度要慢得多，但在27°C和30°C之间的温度下生长速度最好。
05渗透压
渗透压对昆虫细胞的生长和增殖有着重要作用，昆虫细胞通常需要较高浓度的渗透压，所以昆虫细胞培养基中的无机盐浓度较高，且各无机盐离子之间需要平衡，如某些细胞系对Na /K 的比例有严格要求。据报道，最常用的昆虫细胞培养基中的渗透压为340-390mol/kg，而培养脊椎动物细胞时的渗透压为290-330mol/kg。
三、关于我司昆虫细胞培养的进展
众所周知，在水稻虫害中，褐飞虱之害尤其严重。作为一种媒介昆虫，褐飞虱主要传播水稻草矮病毒（RGSV）和水稻齿叶矮缩病毒（RRSV）。使用农药防治时，收效甚微，甚至无济于事。对于这个世界性难题，研究人员也一直在积极寻找破解之策。考虑到可以在细胞上进行植物病毒的研究，我司开展了褐飞虱虫卵原代细胞的提取与单克隆细胞系培养。
但在这个项目进行中也遇到了许多困难：
01潜在的真菌感染风险
使用酶消化法消化虫卵组织块后提取的原代细胞，在细胞周围有许多杆状、串珠状物质，疑似真菌，来源可能是水稻杆或褐飞虱虫卵自身所携带的共生菌，也可能是前期从水稻杆中分离虫卵时，水稻杆上的霉菌被带入了后续的培养体系中。虽然在后续的培养中，这些微生物逐渐消失，但依然有潜在的污染风险。
02褐飞虱虫卵原代细胞贴壁困难
可能是不合适的培养体系造成的（缺乏关键细胞因子），在后续实验中及时调整和优化培养基成分、比例，以及培养所需的条件，细胞能够逐渐增殖，但同时也有部分细胞死亡，由于细胞无法贴壁生长，这些死去的细胞所产生的细胞碎片会悬浮在细胞间与细胞混杂在一起。
03难以获得褐飞虱单克隆细胞系
根据提取出的原代细胞，挑出状态较好的进行单克隆细胞系的培养，刚开始细胞还能缓慢增殖，但几天后会全部死亡。多次实验后发现想从一个细胞培育成一株细胞是比较困难的。鉴于此，我司考虑取同一株水稻相邻的一串虫卵进行原代细胞的提取与培养，由于它们的遗传背景相似，即认为它是同一株细胞系。
参考文献
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