生物技术制药复习
一、名词解释：
1、生物药物：是指利用各种生物材料，综合采用各种生物技术的原理和方法制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。
2、抗生素：由微生物产生，在低浓度下能*灭和抑制病原体，但对宿主不会产生严重的副作用的物质，或使用化学方法半合成的衍生物和全合成的仿制品。广义的抗生素还包括一些抗肿瘤药、*虫剂和除草剂。
3、补料分批发酵： 是指将种子接入发酵反应器进行培养，经过一段时间之后，间歇式地、或者连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的方法。
4、限制性内切酶：生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。
5、载体：将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。
6、转化细胞系：正常细胞经过某个转化过程，失去正常细胞的特点而获得无限增殖能力的细胞系。
7、微载体培养：将细胞吸附于微载体表面，再在培养液中进行悬浮培养，使细胞在微载体表面生长成单层的方法称为微载体培养法。
8、毛状根： 受到发根农杆菌感染后形成的根组织，易于培养，改变了植物的次生代谢。毛状根生长快速和次级代谢产物含量高，特别适用于从木本植物和难于培养的植物中得到较高含量的次级代谢产物。
9、气升式反应器：没有搅拌，气体通过喷管进入剪切力更小，主要用于悬浮细胞的分批式培养，近年开发用于贴壁细胞的微载体培养，并进行半连续、连续和灌流式培养。
10. 酶固定化： 指经物理或化学方法处理，使酶（细胞）限制或固定于特定空间位置，使之不但能连续发挥催化作用，而且反应后酶又可以反复利用的技术。
11. 抗体酶：又称催化抗体，是指通过一系列化学与生物技术方法制备出的具有催化活性的抗体，它除了具有相应免疫学特性，还类似于酶，能催化某种反应。
12. 微生物转化：是通过微生物细胞将复杂的底物进行结构修饰,也就是利用微生物谢过程中产生的某个或某一系列的酶对底物特定部位(基团)进行的一种或几种化学催化反应，使其转化成结构相似的更有价值的新化合物。
13. 多克隆抗体：给动物接种天然抗原所获得的免疫血清或抗血清，是多种抗体的混合物, 它是由多种抗原决定簇刺激多株B细胞增殖分化所产生的, 称为多克隆抗体。
14. 单克隆抗体： 通过B细胞杂交瘤技术, 获得特异性针对某一种抗原决定簇的细胞克隆，产生均一
性的抗体。
15. 基因工程抗体：基因工程抗体：将抗体的基因按不同需要进行改造和*，然后导入适当的受体细胞中进行表达，便产生了第三代抗体－基因工程抗体。
16. 基因工程多肽疫苗： 利用基因工程技术制备抗原成分的亚单位的疫苗称为基因工程多肽疫苗。
17. DNA疫苗：DNA疫苗又称核酸疫苗、基因疫苗，是通过基因*技术把编码抗原蛋白的基因序列克隆到质粒，并在基因的上游加上细胞可以识别的启动子，形成一个表达载体，将这个表达载体DNA直接导入宿主细胞，由细胞的基因转录、转译系统直接合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，达到防病治病目的。
18. 基因治疗：广义上来讲是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。
19. 细胞治疗技术： 将患者自身细胞在体外进行处理后回输体内进行治疗的方法。
20. 生化药物：所谓生化药物是指以天然的动物、植物、微生物等生物体组织和器官为原料，通过化学方法进行提取、精制或者用化工合成方法制成的内源性生理生化物质，用于预防、治疗、诊断疾病。包括由上述这些已知药物加以结构改造或人工合成创造出的自然界所没有的新药物。
二、简答题
1. 简述生物药物新药的研发流程。
答：新药研究和开发的主要过程：
(1) 确定研究计划；
(2) 准备候选菌株；
(3) 选择合适药理模型初筛（摇瓶）、复筛（小型发酵）体外试验、细胞试验；
(4) 提纯有效成分进行化学分析 ；
(5) 精制样品（中型发酵）；
(6) 临床前Ⅱ期(Preclinical Ⅱ) ；
(7) Ⅰ期临床 (Preclinical I)；
(8) Ⅱ期临床 (Preclinical Ⅱ)；
(9) Ⅲ期临床 (Preclinical Ⅲ)；
(10) 注册申请上市、试生产 ；
(11) 售后监测(Post－marketing surveillance)。
2. 简述生物药物的优点和缺点。
答：生物药物是指利用各种生物材料，综合采用各种生物技术的原理和方法制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。
优点：
（1）用量少，药理活性高；
（2）特异性强，治疗的生理生化机制合理，疗效可靠；
（2）毒副作用小、价值高；
（3）缺点：
（1）成分复杂：大多数是混合物；
（2）不稳定：易变性，易失活，易降解。
（3）提取纯化工艺复杂、生产技术难度高；
（4）生理副作用常有发生。
3. 给出下列生物药物的中文名称: IFN；TNF；IL；G-CSF；EPO；GM-CSF；r-SK；r-SAK；GH；EGF；bFGF；rhTPO；t-PA；SRM
答：IFN （人α-干扰素）；TNF （肿瘤坏死因子）；IL （白细胞介素）；G-CSF （粒细胞集落刺激因子）；EPO （促红细胞生成素）；GM-CSF （粒细胞／巨噬细胞集落刺激因子）；r-SK （*链激酶）；r-SAK （*葡激酶）；GH （生长激素）；EGF （表皮细胞生长因子）；bFGF （碱性成纤维细胞生长因子）；rhTPO （*人血小板生成素）；t-PA（ 组织纤溶酶激活剂）；SRM （生长激素释放抑制素）。
4. 简述微生物发酵制药的基本流程。
答：微生物发酵制药基本流程：
菌种选育（自然界选种、诱变育种、基因工程、细胞工程）
培养基配制（根据培养基的配制原则制备，实践中需多次试验配方）
灭菌（*灭杂菌（胞体、孢子及芽孢）
扩大培养和接种
发酵过程（检测进程，满足营养需要；严格控制温度、pH、溶氧、转速等）
分离纯化（菌体：过滤、沉淀；代谢产物：蒸馏、萃取、离子交换）
5、简述基因工程操作流程
答：基因工程的操作流程：
（1）分：分离目的基因；
（2）切：对目的基因和载体适当切割；
（3）接：目的基因与载体连接；
（4）转：*DNA转入受体细胞；
（5）筛：筛选出含有*体的受体细胞；
（6）表：目的基因在受体细胞中表达，受体细胞成长为基因改造生物。
6. 简述化学修饰药用酶的新特征。
答：药用酶修饰后所具有的新特征：
（1）对热的稳定性有所提高。
（2）具有对抗各类失活因子的能力。
（3）抗原性消除。
（4）体内的半衰期有所延长。
（5）最适PH值发生改变。
（6）酶反应特性发生变化。
（7）在人体组织中的分布能力发生变化，有利于被靶器官选择性的吸收。
7. 简述固定化酶生产药物的优点和缺点。
答：固定化酶生产药物的优点：
（1）可以多次使用，酶的稳定性提高；
（2）反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于纯化；
（3）反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制；
（4）酶的利用率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量少。
缺点：
（1）固定化过程中，可能会引起酶活性丧失；
（2）只适用于催化可溶性小分子底物的酶促反应，对大分子底物不适合；
（3）通常不适用于多酶反应，尤其是需要辅助因子参与的反应。
8. 简述单克隆抗体制备的过程。
答：单克隆抗体的制备：
用抗原免疫小鼠 骨髓瘤细胞的培养
免疫脾细胞 骨髓瘤细胞
在PEG作用下合成杂交瘤细胞
选择培养基（融合的细胞死亡，杂交瘤细胞存活）
阳性克隆的筛选机克隆化
克隆扩增及大量制备McAb
9. 简述转基因植物生产药物的优缺点。
答：优点：
（1）价格便宜，易形成产业化规模；
（2）安全，使用方便；
（3）植物具有完整的真核细胞表达系统。
缺点：
（1）表达量偏低；
（2）免疫效果较差；
（3）糖基化不可靠性、生物安全性和公众接受性以及工业化技术问题；
（4）目前转基因植物普遍存在基因沉默或不稳定表达的现象。
10. 简述动物乳腺生物反应器优点及制作过程。
答：哺乳动物乳腺反应器优点：
（1）通过乳汁获得药物，能够获得较高的产量，同时也容易提纯。
（2）乳腺是一个外分泌器官，乳汁不会参与体内循环，也不会影响转基因动物自身的生理代谢过程。
（3）乳汁所表达的蛋白质经过修饰加工之后，具有稳定的生物活性。
（4）对于牛、羊这些大量分泌乳汁的动物来说，动物本身就相当于一座大型的药物工厂。
动物乳腺反应器制作：
药用蛋白基因 表达细胞株 细胞核
供体动物 受精卵 无核受精卵 组装的核细胞 胚胎
药用蛋白 乳汁雌性 转基因动物 动物幼崽 假孕动物
受体动物
三、设计题
请设计一个基因工程药物的生产工艺流程（应包括工程菌构建、扩大培养方法、产物分离纯化、质量检测等环节）。
答：干扰素a-2b 的制备
干扰素（INF）是人体细胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等等作用,是人体防御系统的重要组成部分,干扰素（INF）最早被用于诱导人体产生白细胞。
（1）基因工程菌的组建
诱生的白细胞或者成纤维细胞提取核酸
↓
通过寡dT-纤维素柱提取mRNA pBR322质粒
↓ ↓
5%-23%蔗糖密度梯度离心提取12S-mRNA PstI内切酶切割
↓ ↓
由mRNA转录成cDNA 切割段位于β内酰胺基酶基因内
↓ 结果导致内酰胺基酶失活，不抗青霉素
双链cDNA用末端PstI酶切割 ↓
再用DNA转移酶接上dT或者dG 在pBR322质粒DNA的切割段加上dA或者dC
退火获得杂交质粒
↓
转化大肠杆菌K-12扩增杂交质粒
↓
筛选能够抗四环素、但是对氨苄青霉素敏感的细菌克隆株
↓
采用杂交翻译法挑选含有干扰素cDNA的克隆
↓
将干扰素cDNA克隆进表达载体
↓
在大肠杆菌中进行高效表达
↓
（进入下游工艺）
（2）基因工程菌的发酵生产
人干扰素a-2b的基因工程菌为SW-IFNa-2b/E.coli—DH5a。
质粒使用PL启动子，含有四环素抗性基因。
种子培养液含1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%NaCl
↓
基因工程菌接种到4个1000ml三角烧瓶之中，每个烧瓶内装有250ml种子培养基，30℃摇床培养10小时，作为发酵罐的种子
↓
用15L发酵罐进行发酵，装发酵培养基10L
↓
搅拌转速500r/min、通气量为1：1v/v*min、溶氧量为50%
30℃发酵8小时，42℃诱导2-3小时
↓
鉴控手段：每隔不同时间，取2毫升发酵液，10000r/min离心除去上清液，称量菌体湿重。
（3）干扰素的制备
发酵物质4000r/min离心30min，除去上清液，得湿菌，从其中取100g。悬浮于20mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.0）500ml之中，冰浴条件下进行超声破碎。
↓
4000r/min离心30min，除去上清液。沉淀部分用100ml提取液在室温条件下，进行搅拌抽提2小时
↓
提取液15000r/min离心30min，下层不溶弃去。取上清液，用20mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.0）稀释至尿素浓度0.5mol/L
↓
加入0.1mmol/L二巯基苏糖醇，4℃搅拌15小时。15000r/min离心30min，除去不溶物。上清液用截流量=10000相对分子质量的中空纤维超滤器浓缩
↓
浓缩液采用Sephadex G50层析柱分离，层析柱2cm*100cm、先用20mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.0）平衡固定相，上柱之后，用同一缓冲液洗脱分离
↓
收集人干扰素a-2b部分，用SDS-PAGE检查。再经DE-52柱进行纯化
层析柱2cm*50cm、上柱之后，分别采用含有0.05mol/L、0.10mol/L、0.15mol/L的NaCl的20mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.0）洗涤。
↓
收集含有收集人干扰素a-2b部分。分装→冻干→成品鉴定→成品包装。
（4）质量控制标准和具体要求
（1）半成品检定--13项指标
1、干扰素效价测定；2、蛋白质含量测定；3、比活性测定；
4、纯度测定；5、相对分子量测定；6、残余外源性DNA含量测定；7、残余抗生素活性测定；8、紫外光谱扫描；9、肽图测定；10、等电点测定；11、无菌试验；12、热原质试验。
（2）成品检定--7项指标
1、物理性状；2、鉴别试验；3、水分测定；4、无菌试验；5、热原质试验；6、干扰素效价测定；7、安全试验。
四、论述题
查阅资料，结合你的专业和兴趣，请谈谈某种生物药物生产工艺国内外发展现状，你认为存在哪些技术问题，请提供相应的解决方案。
答：青霉素的生产工艺国内外发展现状：
青霉素属于β-内酯类抗生素,能破坏细菌的细胞壁，可从青霉菌的培养液中提制，对大多数的革兰氏阳性菌引起的疾病都具有明显的治疗效果。我国生产青霉素一部分用作医疗，有少部分可以先分裂后用来合成新青霉素或半合成青霉素。
青霉素的生产，包括发酵过程，发酵过程的控制以及青霉素的提炼。
提炼过程一般是预处理、过滤、萃取、脱色、结晶。最终得到青霉素产品。
青霉素钠的提取工艺有溶媒萃取工艺和离子交换工艺。溶媒萃取是利用青霉素在不同的pH条件下，会以不同的状态存在，从而在水和有机溶剂中具有不同溶解度，通过多次萃取分离即可达到分离提纯的目的。离子交换工艺采用阳离子交换树脂作为交换剂，将青霉素钾盐交换为青霉素钠盐。
目前国内大多数厂家采用混合槽或静态混合器进行混合萃取。但是这种装置结构复杂，拆洗困难，使用不方便。80年代初，已有部分西方国家开始将德国倾析机应用于青霉素生产并取得成功。近几年，国内已有厂家开始引进新型的集过滤、洗涤、干燥为一体的“三合一”全密闭生产设备。国外制药技术发展迅速，由于涉及技术保密，难以参考到有关方面的资料。
我认为存在的技术问题及解决方案有：
（1）发酵过程成本高、能耗大。采用计算机青霉素发酵过程建模的方法对发酵过程进行优化；
（2）发酵单位需进一步提高。可以从菌种选育及发酵过程上进一步提高发酵单位；
（3）菌丝生长后期，酶易失活，糖类转化为抗生素的效率较低。采用固定化细胞或固定化全酶的方法改进发酵；
（4）发酵罐接种工艺存在的问题无法充分发挥某些菌种的优良特性。使用混合接入种源法改良接种工艺；
（5）目前所使用的过滤设备过滤面积小，产能小，在某些条件下收率低。增加鼓式过滤机和热交换器提高收率及滤液质量实现膜萃取分离的方法。
