质粒怎样与目的基因结合,怎样获得载体质粒和目的基因

首页 > 上门服务 > 作者:YD1662023-11-08 00:39:06

PCR的应用(作用)

①构建融合基因

②用于定点突变

③添加酶切位点

④定量检测(检测RNA或DNA)

⑤扩增DNA已知DNA片段两侧的位置序列

⑥配合Klenow酶制备DNA探针

⑦鉴定目的基因是否定向插入(正向或反向都可鉴定,设计一个引物在质粒上,另一个引物在目的基因上)

1.PCR中使用的聚合酶具有末端转移的活性,通常在3'端加上多聚A。PCR扩增过程中,由于不清楚目的基因的完整DNA序列,获得的目的片段通常需要*到T-载体中,通过测序了解DNA序列。LacZ基因在IPTG诱导下的表达产物能够水解X-gal使菌落呈蓝色,否则呈白色。目的基因插入到LacZ中会导致该基因失活,因此可采用蓝白斑法筛选含有*质粒的大肠杆菌。下图为T载体的结构示意图(Amp'为氨苄青霉素抗性基因)。下列说法正确的是(  )

质粒怎样与目的基因结合,怎样获得载体质粒和目的基因(1)

A.为高效连接PCR扩增产物,T-载体用EcoRV酶切后再在3'端添加多聚T突出端

B.通过设计特定的引物借助PCR技术可检测PCR扩增产物在T-载体中的插入方向

C.选择BamHI和HindIII进行双酶切并构建基因表达载体以保证扩增产物正向插入

D.转化后,应选择在含X-Gal和氨苄青霉素培养基上生长的白色单菌落进行测序

2.纤毛是广泛存在的细胞表面结构,功能异常可引起多种疾病。因此,研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。

质粒怎样与目的基因结合,怎样获得载体质粒和目的基因(2)

(1)纤毛结构如图1所示,由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由中心体转变而来,中心体在有丝分裂中的功能是______________________________________。

(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常,为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异,对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时,可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来,溶液中添加NaC1至2.0mo1/L的目的是__________________。PCR扩增时,需在__________________催化下,在引物__________________端进行DNA链的延伸,获得扩增产物用于测序。

(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位,构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白,融合蛋白具有绿色荧光,可示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y,构建Y-M*质粒(在EcoRⅤ位点插入片段)。请完成下表。

质粒怎样与目的基因结合,怎样获得载体质粒和目的基因(3)

分步实验目标

简易操作、结果、分析

PCR鉴定正向*质粒Y-M(图Ⅱ中融合片段M中有白色的箭头,代表方向)

①选择图Ⅱ引物_____________;②PCR目的产物约为_____________bp。

确保M及连接处序列正确,Y-M的连接处上游含有Hind III EcoR V的识别序列,下游含有EcoR V BamH I的识别序列

③质粒测序,图Ⅲ中正确的是____________(选填序列编号)

检测融合蛋白定位

④对照质粒Y-GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y-M分别导入细胞,发现对照组整个细胞均有绿色荧光,而实验组荧光集中在纤毛基部,说明_________________________________________________________

(4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化,采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA,经_____________形成cDNA作为模板,PCR扩增结果显示,在总cDNA模板量相等的条件下,健康人Ct值为15,而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)。从理论上估算,在PCR扩增20个循环的产物中,健康人样品的目的产物大约是病人的_____________倍。

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