第一阶段包括五个步骤
第一步为葡萄糖的磷酸化，葡萄糖在己糖激酶的催化下，消耗一个ATP，在6号c原子上挂上一个磷酸基，生成6-磷酸葡萄糖。
第二步为6-磷酸葡萄糖的异构，在葡糖糖异构酶的催化下，6-磷酸葡萄糖异构为6-磷酸果糖。
第三步为6-磷酸果糖的磷酸化，在6-磷酸果糖激酶1的催化下，消耗一分子ATP，生成1,6-二磷酸果糖。
第四步为磷酸丙糖的生成，1,6-二磷酸果糖在缩醛酶的催化下生成一分子磷酸二羟丙酮和一分子3-磷酸甘油醛。
第五步为磷酸二羟丙酮的异构，磷酸二羟丙酮在丙糖异构酶的作用下生成3-磷酸甘油醛。
至此，丙糖的生成阶段完成，共计消耗一分子葡萄糖，2分子ATP
糖酵解的主要过程和关键酶：第一阶段葡萄糖生成为2分子磷酸丙糖，是消耗能量的过程；磷酸果糖激酶-1是糖酵解途径中最重要的限速酶。
第二阶段磷酸丙糖氧化为丙酮酸，是氧化产能的阶段，此阶段共生成4分子ATP。丙酮酸激酶是糖酵解途中的又一重要的调节酶，具有变构酶性质。第三阶段丙酮酸在不需氧化条件下加氢还原为乳酸。
在糖酵解反应的全过程中，有三步是不可逆的单向反应。催化这三步反应的己糖激酶、磷酸滚烫激酶-1和丙酮酸激酶是糖酵解途径的关键酶，调节这三个酶的活性，可影响糖酵解的反应速度，其中以磷酸滚烫激酶-1的催化活性最低，是最重要的限速酶。
