通过使用这些针对B-DNA或Z-DNA的高度特异性mAb，作者首先研究了Z-DNA是否存在于几种众所周知的生物被膜形成的病原菌中：NTHI、UPEC、Kp、铜绿假单胞菌和使用IF的变形链球菌。作者发现，在所有病原形成的成熟生物膜(40h)的胞外多聚体中都存在丰富的B-DNA和Z-DNA(图1A)。此外，作者还发现，尽管随着时间的推移THI、Kp和UPEC形成的生物膜的EPS中Z-DNA和B-DNA都增加了，这表明，随着生物膜的成熟（至少在体外），Z-DNA继续积累。接下来，作者让气道病原体NTHI在极化的人气道上皮细胞（HAEs）上形成生物膜(图1B)，然后通过IF检测B-DNA和Z-DNA。在没有NTHI的情况下，没有观察到可见的eDNA链(图1C)。相反，在具有顶端形成的NTHI生物膜的HAEs中，可以观察到B-和Z-DNA型eDNA链(图1D)。进一步证实，这些细菌在生物膜形成过程中都存在Z-DNA。然后，作者鉴定了Z-DNA是否也存在于一只患有NTHI的实验性中耳炎的栗鼠中耳中，并检查了一名CF患者的痰，该患者的痰培养对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)和盲肠伯克霍尔德氏菌都呈阳性，Z-DNA(黄色)在这些单一的和混合的生物膜中含量很高（图1E），呈粗大的纤维状，与在HAEs体外形成的生物膜中观察到的相似(图1D)。
Z-DNA是具有未成熟生物膜的eDNA的主要结构形式
为了证明Z-DNA是eDNA的重要结构形式，作者让NTHI、Kp和UPEC在体外形成成熟的生物膜，然后用DNase孵育16h，再用IF显微镜对B-DNA和Z-DNA进行相对定量。结果发现，尽管与DNA酶孵育后B-DNA水平显著降低（图2A），但Z-DNA水平保持不变。用DNase处理和荧光比率的比较表明，生物膜明显向以Z-DNA为主要形式的生物膜转变(图2B)。另外，NTHI生物膜在整个生物膜发育过程中，在DNase的存在下孵育40h，Z-DNA显著减少，B-DNA几乎消失，Z/B-DNA比值强烈有利于Z-DNA。这表明，DNA酶的加入在生物膜发育过程中降解了B-DNA，从而减少了Z-DNA的产生。B-DNA是形成Z-DNA的eDNA库，而抗核酸酶的Z-DNA，对维持细菌生物膜的稳定性至关重要。
eDNA调控生物膜结构的B/Z平衡位移
多价阳离子或高离子强度也能促进B-DNA向Z-DNA转化，而插层剂的结合倾向于B-DNA构象。作者利用这些原理试图诱导eDNA向B-或Z-DNA转变，以确定这两种状态中的哪一种与生物膜的形成有更好的联系。利用氯化铈(CeCl3)在低浓度(<1 mM)下形成自组装的Z-DNA聚集体能力。作者将成熟的NTHI生物膜与浓度增加的CeCl3孵育，然后通过IF显微镜检测Z-DNA的存在。结果表明，从B-DNA到Z-DNA的平衡转变促进了生物膜的形成，促进了生物膜的优势状态而不是浮游生物的生长。另外，对未经处理的(培养基)生物膜以及与DNase、CeCl3孵育的生物膜进行了轴向机械压痕，并确定了压缩生物膜所需的力。从应力-应变曲线可以看出，与未经处理的生物膜相比，经过处理的生物膜的力学性能都有显著差异(图3D)。
为了将Z-DNA转化为B-DNA，作者使用了DNA插入剂氯喹，它可以防止Z-DNA的形成。作者假设氯喹会将成熟生物膜的B-Z平衡主要转向B型，从而降低生物膜结构的完整性。于是，让NTHI建立生物膜(24小时)，然后用增加氯喹浓度培养，再用IF法检测Z-DNA的存在。氯喹使生物膜状态下的Z-DNA信号显著降低，NTHI呈剂量依赖性降低，表明Z-DNA对生物膜的稳定至关重要(图3F-3H)。如上所述，对未经处理的NTHI生物膜(培养基)或与氯喹孵育的生物膜进行轴向机械压痕。应力-应变分析表明，与对照生物膜相比，氯喹处理的NTHI生物膜的杨氏模量（杨氏模量是描述固体材料抵抗形变能力的物理量）明显低于对照生物膜(图3J)，这表明Z-DNA向B-DNA的转化破坏了生物膜的机械完整性。
接下来，作者用NTHI生物膜(40h)与氯喹和DNA酶孵育1h，发现，生物膜的平均厚度显著减少（图3A），这表明EPS使生物膜从抗DNA酶状态转变为对DNA酶敏感状态(图3K)。另外，作者用一种HJ专用的解析瓶证明了HJ的存在对Z-DNA的稳定至关重要，因为HJs的拆分显著降低细菌的生物膜总量（图4A-4D）。
为了证明外源添加HU会增强Z-DNA的积累。作者在HUNTHI(100 nM)存在的情况下，用NTHI在整个生物膜形成过程中孵育40小时。对Z-DNA进行IF，发现与未处理对照相比，Z-DNA的积累明显增加(图4E-4G)。作者在与DNABII蛋白孵育的NTHI生物膜（HUNTHI）、RUSA或两者结合培养的生物膜中加入DNase 1h。应力-应变分析表明，与对照相比，HUNTHI培养的生物膜的杨氏模量明显大于对照组(图4I)。这表明，通过与DNABII蛋白的相互作用，生物膜中的Z-DNA增加，导致生物膜显著变硬，类似于CeCl3诱导的生物膜(图3E)。相反，RusA培养的生物膜的杨氏模量明显低于对照(图4I)，这表明Z-DNA降低了生物膜的机械性能，类似于氯喹处理(图3J)。为了进一步证明CeCl3将B-转化为Z-DNA依赖于eDNA，作者将NTHI生物膜与CeCl3孵育16 h，然后与RusA孵育1h。与单独的CeCl3孵育相比，NTHI生物膜的杨氏模量与RusA相似（降低了）(图3E)。即RusA完全消除了CeCl3转化的生物膜刚性(图4I)，这表明CeCl3刚性的增加依赖于eDNA，而不是生物膜内的其他因素。总之，这些结果证实了细胞外HJs，由DNABII蛋白介导，通过稳定Z-DNA促进了生物膜的机械刚度和结构。
DNABII蛋白在佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯（PMA）诱导的网络中毒过程中驱动B-DNA优势网络向Z-DNA转变
事实上，中性粒细胞等免疫细胞通过网织红细胞释放eDNA和相关的抗微生物化合物(如组蛋白)。免疫细胞如中性粒细胞通过NETosis（中性粒细胞的炎性细胞死亡方式）释放eDNA和相关的抗菌化合物(如组蛋白)来控制病原体。这种真核eDNA的释放为生物膜上的细菌提供了将真核和细菌来源的eDNA结合到其EPS的机会。为了探究DNABII蛋白本身是否也能将真核细胞的eDNA从天然的B型转化为Z型。首先，作者证实了PMA诱导的中性粒细胞产生中性粒细胞胞外网状陷阱(Net)（图5A）。并确定在PMA诱导的网络中，eDNA的主要形式是B-DNA。为了重述接触细菌生物膜及其相关DNABII蛋白的情况，作者在PMA诱导时加入了HUNTHI中性粒细胞。结果显示，HU不仅浓缩了PMA诱导的Nets，而且将一定比例的eDNA从B型转变为Z-DNA。相反，CbpA，另一种次要的沟槽DNA结合蛋白同样通过NTHI释放，未能改变b型DNA的外观或比例。已知DNA酶能使NETs失活，并导致灭菌活性丧失。作者用DNase、HUNTHI、CbpA或NTHI缓冲液孵育中性粒细胞4小时。将Triton X-100添加到溶解中性粒细胞中，使细胞内活菌得以恢复，并测量MN NETosis的细菌*灭率。结果显示，与培养基控制或CbpA相比，添加DNA酶或HU导致NETs可测量的细菌*灭率显著降低。这些共同的结果表明，DNABII蛋白与宿主来源的eDNA的接近不仅会影响eDNA的形式，而且还会影响宿主细胞*灭细菌病原体和/或控制细菌生物膜增殖的能力（图5C）。
在NTHI攻击11天后从龙猫中耳恢复的生物膜中发现，宿主蛋白(例如HMGB1)定位于PMN和PMN衍生的eDNA附近，而DNABII蛋白主要定位于细菌生物膜附近。然而，在这个宿主-病原*界处，这两种蛋白都被IF观察到。HMGB1破坏细菌生物膜的能力和Net介导的DNABII蛋白*菌功能的失活，表明在这个界面上有一个微妙的平衡。为了在同一冰冻切片中检查这些区域的B-和Z-DNA的空间分布，作者观察到一个密集而广泛的富含PMN的区域，位于附着在中耳粘膜的细菌生物膜之上(图6A和6B)。PMN密集区域在eDNA晶格中包含B-和Z-DNA，然而，粘附的NTHI生物膜主要富含Z-DNA(图6C-6E)。中耳腔内生物膜上方的最上面部分主要含有B-DNA(图6F)。最上面的三分之一“较新的”PMN区域(图6G)包含两种形式的DNA，而最接近细菌生物膜的底部三分之一“较老的”PMN区域(图6H)主要包含Z-DNA。Z-DNA是粘附在中耳粘膜上的细菌生物膜中eDNA的主要形式(图6I)。
