图6.高压梯度装置结构示意图
低压梯度只需一个高压泵,与等度洗脱输液系统相比,就是在泵前安装了一个比例阀,混合就在比例阀中完成。在常压下混合往往容易形成气泡,所以低压梯度通常配置在线脱气装置。
图7.四元低压系统结构示意图
4.进样系统早期使用隔膜和停流进样器,装在色谱柱入口处。现在大都使用六通进样阀或自动进样器。进样装置要求:密封性好,死体积小,重复性好,保证中心进样,进样时对色谱系统的压力、流量影响小。
一般HPLC 分析常用六通进样阀,六通阀的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。
①部分装液法进样:进样量应不大于定量环体积的50%(最多75%),并要求每次进样体积准确、相同。此法进样的准确度和重复性决定于注射器取样的熟练程度,而且易产生由进样引起的峰展宽。
②完全装液法进样:进样量应不小于定量环体积的5~10 倍(最少3倍),这样才能完全置换定量环内的流动相,消除管壁效应,确保进样的准确度及重复性。
图8.六通进样阀构造原理示意图
5.分离系统分离系统包括色谱柱、保护柱以及柱温箱。
色谱柱:色谱是一种分离分析手段,分离是核心,因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。色谱柱由柱管、压帽、卡套(密封环)、筛板(滤片)、接头、螺丝等组成。色谱填料为经过制备处理后,用于填充色谱柱的物质颗粒,通常是5-10粒径的球形颗粒。色谱柱按用途可分为分析型和制备型两类,尺寸规格也不同:
①常规分析柱(常量柱),内径2~5mm(常用4.6mm,国内有4mm 和5mm),柱长10~30cm;
②窄径柱(narrow bore,又称细管径柱、半微柱semi-microcolumn),内径1~2mm,柱长10~20cm;
③毛细管柱(又称微柱microcolumn),内径0.2~0.5mm;
④半制备柱,内径>5mm;
⑤实验室制备柱,内径20~40mm,柱长10~30cm;
⑥生产制备柱:内径可达几十厘米。
图9.色谱柱结构示意图
保护柱:保护柱的作用主要是防止吸附性强的杂质对色谱柱污染,从而延长色谱柱的寿命。针对不同型号的色谱柱,应选择相对应填料的保护柱。应注意柱芯也是有寿命的,应该定期进行更换。
柱温箱:维持色谱柱温度的恒定,以免造成保留时间的变化,保证分离效果的稳定性。
6.检测器检测器是用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置,是HPLC 仪的三大关键部件之一。HPLC的检测器要求灵敏度高、噪音低(即对温度、流量等外界变化不敏感)、线性范围宽、重复性好和适用范围广。