O-糖基化也是常见的翻译后修饰，是糖基与肽链中氨基酸侧链羟基生成O-糖苷键的糖基化方式。可用于成键的羟基主要是丝氨酸和苏氨酸的醇羟基，也包括羟赖氨酸的羟基（如胶原蛋白），还有酪氨酸的酚羟基（如糖原蛋白）。
胶原蛋白中的羟赖氨酸可以被糖基化修饰。Essays Biochem. 2012; 52: 113–133.
N-糖基化是预先合成一段核心糖链，然后整体转移到受体肽段上；O-糖基化通常是将活化的糖基逐一转移到相应残基上。所以N-糖基化要用到寡糖基转移酶（oligosaccharyltransferase），而O-糖基化用各种糖基转移酶（glycosyltransferases，GT）。
GT的底物是各种活化的糖基。不同糖基的活化方式不同，但都是与核苷酸相连。葡萄糖和半乳糖的活化载体是UDP，甘露糖和岩藻糖是GDP，唾液酸是CMP。活化过程一般在细胞质中进行，然后由相应的转运蛋白把产物转运到内质网或高尔基体。在内质网中还有依赖磷酸多萜醇的转运途径。
活化单糖向高尔基体的转运与糖基转移反应。Cold Spring Harb Perspect Biol. 2011 Apr; 3(4): a005199.
高尔基体中含有多种GT和糖苷酶，用于对N-糖链和O-糖链进行修饰。这些酶分布在不同的区室中，蛋白质在移动过程中依次接受不同的修饰。高尔基体膜是动态循环的，有顺行和逆行的囊泡运输。所以酶的分布也是动态的，有时是重叠的，有些酶还会循环到内质网。
高尔基体各区室的糖基转移酶和糖苷酶。Cold Spring Harb Perspect Biol. 2011 Apr; 3(4): a005199.
O-糖基化的分类一般根据第一个与肽链相连的糖基进行。人体的O-聚糖有7种主要类型，其中最常见的是粘蛋白型（mucin-type），第一个糖基是N-乙酰半乳糖胺（-GalNAc- 1–Ser / Thr）。
