食品生产线每两小时取样1次，异常停机时再取一次。每天取样12瓶，然后在12瓶中随机抽取3瓶做微生物检测。
做微生物之前，在缓冲间用75%的酒精对样品外表进行*菌。之后送到传递窗口处。避免样品对无菌间造成二次污染。
工作台面与工人手表面采样与测试方法
样品采集
工作台:将经灭菌的内径为5cmX5cm的灭菌规格板放在被检物体表面，用以浸有灭菌生理盐水的棉签在其内涂抹10次，然后剪去手接触部分棉棒，将棉签放入含10mL灭菌生理盐水的采样管内送检。
工人手:被检人五指并拢，用以浸湿生理盐水的棉签在右手指曲面，从指尖到指端来回涂擦10次，然后剪去手接触部分棉棒，将棉签放入含10mL灭菌生理盐水的采样管内送检。
细菌菌落总数检测
将已采集的样品在6h内送实验室，每支采样管充分混匀后取1mL样液，放入灭菌平皿内，倾注营养琼脂培养基，每个样品平行接种两个平皿，置35℃土2℃培养48h,计数平板上细菌菌落数。
空气采样与测试方法
样品采集
在动态下进行。
室内面积不超过30m3，在对角线上设里中外三点:里、外点位置距墙1m;室内面积超过30m3,设东西南北中5点，周围4点距墙1m。采样时，将含营养琼脂培养基的平板(真径9cm)置采样点(约桌面高度)，打开平皿盖，使平板在空气中暴露5min。
细菌培养
在采样前将准备好的营养琼脂培养基置35℃土2℃培养24h,取出检查有无污染，将污染培养基剔除。
将已采集的培养基在6h内送实验室，于35℃土2℃培养48h,观察结果，计数平板上细菌菌落数。
三、培养基与试剂制备的制备和*菌
试剂的配制
1、无菌生理盐水的配制
用精确到0.01g的电子称称取8.5g微生物检测专用盐，在100mL 烧杯中用二次净化水溶解后，转移到1000mL的无色透明的容量瓶并用二次净化水定容到1000mL备用。
2、营养琼脂培养基的配制
称取35g营养琼脂培养基用二次净化水在250mL的烧杯中溶解后，转移到1000mL的无色透明的容量瓶并用二次净化水定容到1000mL。然后用250mL的锥形瓶分装备用。
试剂的分装
(1)生理盐水的分装
将配置好的生理盐水用500mL的量筒按照每个锥形瓶装225mL的量进行分装。分装好用乳胶锥形瓶塞塞好锥形瓶，并用牛皮纸将瓶口包扎好。
(2)营养琼脂的分装
将配置好的营养琼脂用500mL的锥形瓶装进行分装。分装好用乳胶锥形瓶塞塞好锥形瓶，并用牛皮纸将瓶口包扎好。
(3)孟加拉红琼脂的分装
将配置好的营养琼脂用500mL的锥形瓶装进行分装。分装好用乳胶锥形瓶塞塞好锥形瓶，并用牛皮纸将瓶口包扎好。
(4)乳糖胆盐肉汤的分装
将配置好的乳糖胆盐用10mL的量管分装在玻璃试管中，试管规格为15*150mm,锥形瓶装进行分装。分装好用乳胶锥形瓶塞塞好锥形瓶，并用牛皮纸将瓶口包扎好。
压力蒸汽灭菌温度和时间
培养基和试剂灭菌
2.1培养基通常应采用高压湿热灭菌法，121℃灭菌15min,特殊培养基按使用者的特殊要求进行灭菌(如含糖培养基，115℃灭菌20min。)
2.2部分培养基(如嗜盐琼脂培养基，胆硫乳培养基等)，只能煮沸灭菌。
2.3对热敏感的培养基或添加物质，应采用膜过滤方法进行过滤除菌。
2.4即用型试剂不需灭菌，应参见相关国际标准或供应商使用说明，直接使用。
试剂的*菌
(1)生理盐水的*菌
将分装完毕的生理盐水，放在*菌釜内，摆放好。然后关上*菌釜， 打开电源，升温到80℃时，打开放气阀进行放气，带放气阀门喷出大量水蒸气时关上放气阀。升温至121℃开始计时，*菌30min停止加热，进行自然冷却，待压力回归零时，打开放气阀门进行放气。等待条菌釜内气压全部排净完后打开*菌釜，将生理盐水取出送往微生物操作间的小窗内。
(2)营养琼脂的*菌
将分装完毕的营养琼脂，放在*菌釜内，摆放好。然后关上*菌釜，打开电源，升温到80℃时，打开放气阀进行放气，带放气阀门喷出大量水蒸气时关上放气阀。升温至121℃开始计时，*菌30min停止加热，进行自然冷却，待压力回归零时，打开放气阀门门进行放气。等待*菌釜内气压全部排净完后打开*菌釜，将生理盐水取出送往微生物操作间预处理间的水浴锅，进行保温，水浴锅的温度46土1℃.
培养基的配制
1、孟加拉红琼脂培养基的配制
称取36g营 养琼脂用二次净化水在250mL的烧杯中溶解后，转移到1000mL的无色透明的容量瓶并用二次净化水定容到1000mL。然后用250mL的锥形瓶分装备用。
2、乳糖胆盐肉汤的配制
称取36g营养琼脂用二次净化水在250mL的烧杯中溶解后，转移到1000mL的无色透明的容量瓶并用二次净化水定容到1000mL。然后用250mL的锥形瓶分装备用。
培养基的*菌
(1)孟加拉红琼脂的*菌
将分装完毕的营养琼脂，放在*菌釜内，摆放好。然后关上*菌釜，打开电源,升温到80℃时，打开放气阀进行放气，带放气阀门喷出大量水蒸气时关上放气阀。升温至121℃开始计时，*菌30min停止加热，进行自然冷却，待压力回归零时，打开放气阀门进行放气。等待*菌釜内气压全部排净完后打开*菌釜，将生理盐水取出送往微生物操作间预处理间的水浴锅，进行保温，水浴锅的温度46℃士1℃。
(2)乳糖胆盐肉汤的*菌
将分装完毕的乳糖胆盐发酵管，放在*菌釜内，摆放好。然后关上*菌金，打开电源，升温到80℃时，打开放气阀进行放气，带放气阀门喷出大量水蒸气时关上放气阀。升温至121℃开始计时，*菌30min停止加热，进行自然冷却，待压力回归零时，打开放气阀门进行放气。等待*菌釜内气压全部排净完后打开*菌釜，将生理盐水取出送往微生物操作间的小窗内。
培养皿和吸量管的*菌
培养皿将培养基处理完，用84消毒液浸泡30min后，用洗洁精清洗干净后用干燥箱烘干( 160℃、30min)后，用牛皮包扎好，在160℃干热*菌2小时。1mL的吸量管也用84消毒液浸泡30min后，用洗洁精清洗干净后用干燥箱烘干( 160℃、30min)后，用牛皮纸包扎好，在160℃干热*菌2小时。
器具和设备灭菌
湿热灭菌:采用高压灭菌器，121℃灭菌20min,适用于玻璃器皿、移液器吸头、塑料瓶等按照GB 15981的规定，评价高压灭菌器的*菌效果。
干热灭菌:采用干燥箱灭菌，160℃灭 菌2h,180℃灭菌1h，适用于玻璃器皿，不锈钢器具等。
液体消毒剂消毒:使用适当浓度的自配或商业液体消毒剂对工作台面、器具或设备表面进行消毒。可按照GB 15981的规定，评价自配或商业消毒剂的消毒效果;可按照ISO 18593,监测工作台面、器具或设备表面的消毒效果。
培养基常见问题
培养基不能凝固
pH值不正确
产生沉淀
颜色异常
培养基出现抑制重复性差
选择性差
培养基pH值不正确的原因
制备过程中过度加热;
水质不佳;
外部化学物质污染;
测定pH值时温度不正确;
pH计未正确校准;
脱水培养基质量差。
培养基不能凝固的原因
制备过程中过度加热:
低pH值造成培养基酸解;
称量不正确;
琼脂未完全溶解;
培养基成分未充分混匀。
培养基产生沉淀的原因
制备过程中过度加热;
水质不佳;
脱水培养基质量差;
pH未正确控制。
培养基颜色异常的原因
制备过程中过度加热;
水质不佳;
脱水培养基质量差;
pH不正确;
外来污染。
培养基出现抑制重复性差
制备过程中过度加热;
水质不佳;
脱水培养基质量差;
使用成分不正确，如：成分称量不准，添加物浓度不正确。
培养基选择性差的原因
制备过程中过度加热;
脱水培养基质量差;
配方使用不对;
添加成分不正确，如加入添加成分时培养
基过热或添加浓度错误。
四、微生物实验操作
