载体构建(vectorconstruction)：载体构建是分子生物学研究常用的手段之一。主要包括已有载体多克隆位点（MCS）的改造和已有载体启动子、增强子、筛选标记等功能元件的改造。是为把DNA分子运送到受体细胞中去，必须寻找一种能进入细胞、在装载了外来的DNA片段后仍能照样复制的运载体。理想的运载体是质粒(plasmid)，在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。载体构建即是构建含外源DNA的质粒。
特点：当给质粒插入一段外源DNA片段后，它依然能够进行自我复制。
多克隆位点
多克隆位点（multiple cloning site, MCS），指的是包含数个（最多20个）限制性酶切位点（restriction site）的一段很短的DNA序列。也称为多位点接头（polylinker），是基因工程中常用到的载体质粒的标准配置序列。MCS上含有多个单一酶切位点，是外源DNA的插入部位，每个限制性酶切位点通常是唯一的，即它们在一个特定的载体质粒中只出现一次。不同酶的酶切位点可有重叠。单一酶切位点就是只有一种特定的酶能够识别并进行酶切的位点，多克隆位点一般是位于质粒上的一段序列，这段序列含有很多个酶切位点，但这些酶切位点每一个都被一种酶识别并酶切。
质粒构建
（1）质粒构建原理
质粒构建是分子生物学研究中最常用的实验技术。原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
（2）质粒构建方式
质粒构建方式多样，常规的T4连接酶，下面就介绍下T4连接酶构建质粒方法，T4连接酶可用于平末端也可用于粘性末端连接，但一般推荐适用黏性末端。
（3）质粒载体的制备
质粒载体的制备既可以选择单酶切也可以选择双酶切，一般推荐使用双酶切。其实目的就只有一个，尽量使载体的末端具有特异性，防止自连。
一般目的基因用于克隆表达的情况下，酶切位点的选择要考虑到：
（1）选择质粒上两个酶切位点的距离不应小于太小（>10bp），否则影响限制性内切酶对切点的识别，不利于空载体的双酶切。
（2）一般目的基因用于克隆表达的情况下，酶切位点的选择要考虑到：
目的基因片段内部不含有所选的酶切位点（不然鉴定阳性*子双酶切时会将目的基因切断）。
（3）实验后继应用的所有载体（真核、原核、酵母、昆虫）都尽可能含有所选的酶切位点。并且要保证在载体上的插入方向正确（定向克隆）。（不然换载体表达时，还要重新设计引物，以引进新的酶切位点）。
（4）尽可能选比较常用的酶切位点（常用切点酶的价格比较便宜）。
（5）两个酶切点至少隔上3个碱基。
（6）两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。
（7）最好使用酶切效率高的酶。
（8）最好使用双酶切有共同buffer的酶。
注：质粒构建完成后可利用PCR原理进行测序验证。
载体构建过程
1、引物设计
2、目的片段选取：RNA提取、RNA反转录、PCR扩增、PCR产物纯化
3、双酶切
4、连接:T4 DNA ligase连接或者同源*连接（新贝生物：#B101、#B102）
5、转化
6、菌落PCR
7、测序：1)摇菌；2)送样; 3)比对 ；
8、菌种保存：菌种比对成功，则可保存菌种备用。
9、质粒提取：菌种比对成功，冻存菌种后，菌液用于提取质粒。
载体构建基本原理
分、切、连、转、筛
1、分：分离出要克隆的目的基因及载体。
2、切：用限制性内切酶切割目的基因和载体，使其产生便于连接的末端。
限制性内切酶：是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。
限制性核酸内切酶根据识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性分为三大类。
其中Ⅱ型酶能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内切割，产生特异性DNA片段，是DNA*技术中常用的酶。
Ⅰ型酶：具有修饰和切割功能，无固定切割位点
Ⅲ型酶与Ⅰ型类似，能识别特异位点，但切割位点在识别位点以外
Ⅱ型酶特点：
①识别顺序一般为4－6个碱基对
②识别顺序具有180度的旋转对称性，呈完全的回文结构
③Ⅱ型酶对双链DNA两条链同时切割，可产生两种不同末端：平末端，粘末端
平末端：在识别顺序的对称轴上，对DNA同时切割形成平末端，如：SmaI
5’－CCC GGG－3’ 5’－CCC GGG－3’
3’－GGG CCC－5’ 3’－GGG CCC－5’
5′突出粘末端：在识别序列的两侧末端切割DNA双链，于对称轴的5 ′末端切割产生5 ′端突出的粘性末端，如：Hind Ⅲ
5’―AAGCTT―3’ 5’― A 5’－AGCTT―3’
3’―TTCGAA―5’ 3’― TTCGA－5’ A―5’
3′突出粘末端:与5′突出粘末端作用相反，产生3 ′端突出粘末端，如：PstI
5’―CTGCAG―3’ 5’―CTGCA－3’ G―3’
3’―GACGTC―5’ 3’―G 3’－ACGTC―5’
3、连：将切割后的目的基因和载体用T4 DNA连接酶连接或者同源*方法连接。
①来源：T4 DNA连接酶是T4噬菌体基因30编码的产物。最早是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中提取的。分子量为68KD，。
②最佳pH7.2-7.8，常用的反应液为pH7.6的Tris－Hcl
③需要ATP作为辅助因子并由ATP提供能量
④DTT等巯基化合物可促进连接酶的连接作用
⑤高浓度的钠、钾离子等抑制酶活性
4、转：把连接好的*载体转化入感受态细胞的过程（细菌：E.coli，真菌：Yeast，昆虫细胞或哺乳动物细胞）。
5、筛：在不同层次上、不同水平上进行筛选，鉴定所需的特异性*子。使用各种方法，将带有*载体的宿主菌从培养基中筛选出来。例如：载体大小，酶切结果，筛选标记等。
文章来源：【合联启程GMP】微信公众号
