质粒到底是什么？病毒？生物武器？万恶之源？在它身上到底有何奥秘与神奇之处？
撰文 | 贺文辉（陆军军医大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室）
DNA储存着世代相传的遗传信息，被誉为“生命的密码”。从沃森和克里克发现DNA双螺旋结构的那一刻起，DNA的“魔幻之盒”被打开，越来越多不同类型的DNA分子被解密。研究发现，大多数DNA分子呈线性结构，例如人的染色体DNA，如果将单个体细胞中的DNA分子全部展开，长度可达2-3米。然而有一类存在于细菌中的DNA分子却呈环状，穿梭在浩瀚的DNA分子宇宙。虽然它的大小只有细菌染色体的千分之一，却魔力无穷——它就是神奇的“质粒”（plasmid）。
左：细菌染色体DNA的线性结构；右：质粒的环状结构
（By User: Spaully on English wikipedia - Own work， CC BY-SA 2.5，https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=2080850）
似病毒而非病毒
20世纪40年代，炭疽热横行美洲。这是一种人畜共患的急性传染病，起初流行于美国德克萨斯州的鹿群，造成大批鹿群死亡。随后在人群中发现了同样的症状：皮肤坏死、溃疡、焦痂、毒血和组织广泛水肿……最终，感染者因出现肺、肠和脑膜的急性感染而丧命[1]。
科学家们试图通过寻找感染源来攻克这一传染病。他们发现，真凶是炭疽杆菌中的一种毒性物质。并且，他们认为这种物质为病毒，通过快速繁殖而感染宿主细胞，引发动物或人生病。直到1950年，美国生物学家乔治·莱德伯格（Joshua Lederberg）才证实这种物质并非病毒，并于1952年将其命名为“质粒”。
质粒是一种大小在1-200kb不等的环状DNA分子，独立于细菌染色体之外，并且具有自我复制能力。细菌中的质粒含量最为丰富，螺旋体、放线菌和酵母等微生物中也有发现。电镜下的质粒是共价、闭合、环状、小型的双链超螺旋DNA分子，形似“麻花”[2]。由于发现质粒和其在细菌基因*中的功能，莱德伯格斩获了1958年的诺贝尔生理学和医学奖。那么，质粒与病毒到底有何异同，为何能迷惑科学家如此之久？首先，质粒与病毒一样，都能进行自我复制，快速繁殖；其次，它们都能赋予宿主一定的表型，引发性状改变。但两者的不同也很明确：病毒是由一个核酸分子（DNA或RNA）与蛋白质构成的非细胞形态，是寄生于生命体甚至非生命体的入侵有机物种。一般的病毒都有两到三个组成成分：RNA或DNA，蛋白质，脂质（部分病毒没有）。而质粒只有一种成分，即DNA，并且质粒还是细胞的组成部分。
虽然病毒和质粒并不相同，但存在千丝万缕的联系。2017年，澳大利亚新南威尔士大学的研究团队在南极考察时，在古细菌体内发现了一种特殊的质粒，它的外表和行为都很像病毒，却缺少表明其是病毒的基因。可以说，这是一种带有病毒属性的质粒。研究团队据此推测，最早出现的病毒可能就是从这样的质粒进化而来的[3]。
不安分的独行侠
质粒DNA如同“黑客”一般，能够摆脱宿主染色体DNA复制调控系统的束缚，独立“编程”自主复制。这主要归功于质粒DNA上的复制起始位点，可以开启自身的复制，还有相应的调控基因，可以控制复制的频率。这意味着质粒能够改变宿主细菌的特性，从而发挥效力。
此外，质粒还具有可转移性。在天然条件下，借助细菌的接合作用，绝大多数野生型质粒可以从一个宿主细胞转移至另一个宿主细胞，甚至还可以进入亲缘关系较近的不同种宿主菌中。这一过程依赖于质粒转移相关基因——mob基因的表达产物与其他蛋白因子的相互作用：mob基因编码移动相关蛋白，在tra转移蛋白的结合作用下，将质粒转移到新宿主细胞的nic缺口位点，质粒即可通过缺口进入到新的新宿主细胞中[4]。然而，一山不容二虎，如果两种质粒具有相同或相似的复制子结构及调控模式，它们就不能稳定地存在于同一宿主细胞内，这种现象称为质粒的不相容性。
生物武器黑历史
质粒的宿主细菌很多，有我们熟知的大肠杆菌、枯草杆菌，还有令人闻风丧胆的炭疽热芽孢杆菌（炭疽杆菌）。依托这一菌种研制的生物武器——炭疽弹，是人类开始认识病原菌后研发的第一个生物武器。
1870年，科学家罗伯特·科赫（Robert Koch）分离出炭疽杆菌。他发现这种细菌生命力极强、易培养、稳定性高，体外保存六个月仍能保持足够的毒性和感染性。然而，科赫当时并不知道炭疽杆菌致命的真正原因。直到19世纪末，科学家才发现炭疽杆菌毒力因子的来源是pXO1和pXO2两个质粒。其中质粒pXO1含有编码产毒基因，可以产生毒力因子和各种毒素，质粒pXO2含有编码细菌荚膜蛋白合成所必须的基因。两个毒性质粒彼此依存，任何一个质粒缺失都将降低炭疽杆菌的毒性，产生减毒株[5]。
炭疽杆菌电镜观察图（来源：美国CDC - Janice Haney Carr）
第一次世界大战期间，德国间谍部门将炭疽杆菌装入可消化试管，包埋于饲料当中，以毒*中立国的军马，拉开了现代细菌战的帷幕。1928年，苏联生物武器之父雅科夫·费什曼（Jacov Fishman）发现炭疽杆菌有很高的强度和韧性，能承受爆炸冲击和干燥处理，因此可以装入炸弹、炮弹和导弹，实现武器化，未来可能成为对人类威胁最大的一种生物战剂[6]。1939年，臭名昭著的日本731部队在我国华中浙、赣地区大量培养炭疽杆菌，并用活人进行细菌试验及细菌武器效能试验，致使我国军民大批死亡。其中HA型炸弹（哈弹）即为炭疽杆菌炸弹，外型酷似普通的钢壳炸弹，而内含的榴霰弹一旦爆炸，炭疽杆菌就会通过伤口感染*伤目标，同时造成可延续数十年的地面污染。1942年，英国征用了苏格兰的一个小岛——格林亚德岛进行炭疽杆菌试验，计划向德国牧场投放炭疽弹*死大批牲畜，以切断肉食供应（因此该计划又称“素食行动”），同时制造全国性的炭疽热爆发，以除掉希特勒的纳粹政权。二战结束后，美国一直秘密进行炭疽战剂的研发，如R-400型炸弹。然而，美国在2001年遭遇了前所未有的生物恐怖袭击，被称为“美国炭疽事件”。这一事件引起了全球范围的军事反思，各国陆续开始履行《禁止生物武器公约》，生物武器的研发目的从攻击转为防御。炭疽杆菌的研究严格限于实验室内进行，包括炭疽杆菌的基因改造以及疫苗的研发。目前，包括我国在内的很多国家已经研制出炭疽杆菌疫苗。
炭疽杆菌疫苗（来源：疫苗生产商Emergent BioSolutions）
亦魔也亦佛
当然，质粒并不是万恶之源。20世纪70年代，科学家开始对天然野生型的质粒进行改造，并应用于基因工程技术，开启了基因工程新的大门。在保留天然质粒优势的基础上，人工改造的质粒增加了抗性标记，人们可以根据需求筛选不同的菌株。同时，质粒上还可以设计多克隆位点，利用相关的酶将质粒分子打开，接入外源DNA，利用质粒自我独立复制的特性，将外源DNA的信息传递给宿主细菌，从而实现性状的改造。
构建*质粒的步骤：1. 获取含有质粒的菌株；2. 提取质粒并用相应的酶剪切质粒；3. 外源基因连接到剪切后的质粒，构建*质粒；4. *质粒转入新的菌株；5. 新的菌株获得新的性状。（来源：http://eschool.iaspaper.net/what-is-genetic-modification/the-process-of-genetic-engineering/）
根癌农杆菌致瘤质粒（tumor-inducing plasmid，简称Ti质粒）的发现具有划时代意义，引导人类进入转基因技术时代。Ti质粒是存在于根癌农杆菌细胞拟核区之外的能自主复制的双链环状DNA分子。1977年，比利时分子生物学家马克·万·蒙塔古（Marc Van Montagu）和约瑟夫·舍尔（Jozef Schell）证实，这种Ti质粒能将外源基因整合到宿主植物的基因组中，产生优良性状，如抗病虫害、抗盐碱、耐除草剂、延长果蔬贮存期等，利用这一过程还可生产药物、抗体、疫苗等。
与Ti质粒相关的应用中，最引人注目的是转基因食品。从理论上讲，人类可以通过Ti质粒转化手段，按照自己的意愿改造植物，得到所需要的食品。事实上，自从1983年科学家将来自细菌的氯霉素抗性基因转入烟草中，并获得世界上第一例转基因植物开始，人类就没有停止转基因食品的研制。越来越多的转基因食品走出实验室，走进人们的生活，如转基因大豆、转基因马铃薯等。
以转基因马铃薯为例，科学家将含有抗旱相关基因的DNA片段通过PCR技术进行体外扩增，合成之后利用各类酶剪切DNA片段，再把产物拼接于Ti质粒多克隆位点处，得到*质粒。*后的质粒通过根癌农杆菌介导，侵染马铃薯愈伤组织，作物即可获得外源抗旱基因，从而表现出耐旱性。
转基因马铃薯培育步骤：1. 获取Ti质粒；2. 获取目的基因；3. 构建*质粒；4. 根癌农杆菌介导转化侵染薯块；5. 形成愈伤组织；6. 愈伤组织发芽成苗；7. 试管苗结薯；8. 结成的小薯种入大田无性繁殖；9. 形成具有目的性状的马铃薯。（作者制图）
争议与前景
从诞生的一刻起，围绕转基因食品的争议就从未停息。虽然还没有任何证据表明转基因食品会对人体健康造成危害，但是对于基因操作过程中可能发生的意想不到的变化，以及其对于健康和环境的长期影响，目前科学研究还不够深入。因此，很多国家和地区，如美国、英国、法国、澳大利亚、新西兰等，都制定了相应的法律法规，对转基因食品进行标注和严格管控。
与此同时，随着克隆技术的不断发展，质粒的“魔力”也越发得以施展，人工构建的质粒DNA序列的克隆、扩增、表达及保存得到了广泛的应用。2017年，世界上首对体细胞克隆猴“中中”“华华”诞生，标志着我国在非人灵长类疾病动物模型研究中处于国际领先地位。这种依托质粒载体的无性克隆体系，加速了针对多种脑疾病（阿尔茨海默病、自闭症等）以及免疫缺陷、肿瘤、代谢性疾病的新药研发进程。
体细胞克隆猴“中中”和“华华”日常生活状态（来源：中科院脑科学与智能技术卓越创新中心）
质粒虽然是微生物细胞中的极为微小的组分，但是在生物学的发展中具有十分重要的作用和远大的前景[7] 。它像一把钥匙，打开了基因的“魔盒”，既为人类带来健康和福祉，又可能引发灾祸与战争。在生物技术迅猛发展的今天，我们只有利用好这把双刃剑，才能让质粒继续造福人类，推进社会的可持续发展。
参考文献
[1] Dibyendu Banerjee, Baishali Chakraborty, Banya Chakraborty. Anthrax: Where Margins are Merging between Emerging Threats and Bioterrorism[J]. Indian Journal of Dermatology, 2017, 62(5):456-458.
[2] BIRNBOIM,H C. A rapid alkaline extraction method for the isolation of plasmid DNA[J]. Methods in Enzymology, 1983, 100.
[3] Erdmann S , Tschitschko B , Zhong L , et al. A plasmid from an Antarctic haloarchaeon uses specialized membrane vesicles to disseminate and infect plasmid-free cells[J]. Nature Microbiology, 2017, 2(10).
[4] María Pilar Garcillán-Barcia, María Victoria Francia, Cruz F D L . The diversity of conjugative relaxases and its application in plasmid classification [J]. FEMS Microbiology Reviews, 2009, 33(3):657-687.
[5] Genomic Characterization and Copy Number Variation ofBacillus anthracisPlasmids pXO1 and pXO2 in a Historical Collection of 412 Strains[J]. Msystems, 2018, 3(4).
[6] Sou-ichi, Makino.[Anthrax as a biological weapon].[J].Shokuhin eiseigaku zasshi. Journal of the Food Hygienic Society of Japan,2002,43(3):J228-32.
[7] Smalla K , Top E M , Jechalke S . Plasmid Detection, Characterization, and Ecology[J]. Microbiology Spectrum, 2015, 3(1)
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