图7:1986年Steen Willadsen以独立作者发表在Nature上的利用绵羊胚胎细胞核移植获得的克隆绵羊。
第一例核移植灵长类动物
1997,恒河猴
1997年,Li Meng与Don Wolf等人利用以上绵羊的核移植方法,首次开展了对灵长类动物核移植的研究。他们发现胚胎卵裂球与去核卵细胞形成的重构胚胎不仅能在体外进行卵裂发育,且移植入受体猴子宫后,成功获得了2只健康存活的个体【9】,见图8。这是第一例核移植灵长类动物,为体细胞克隆猴提供了实验依据。
图8:1997年Li Meng与Don Wolf等利用恒河猴胚胎细胞核移植成功的获得2只克隆个体。
第一例体细胞核移植哺乳动物
1997,绵羊Dolly
1997年,Ian Wilmut与Keith Campbell等在胚胎细胞核移植绵羊的基础上,利用成年芬多斯母羊的乳腺上皮细胞与苏格兰黑面母羊的去核卵细胞进行电融合,获得重构胚胎,发现此重构胚胎能够体外继续发育至桑葚和囊胚期,然后他们将这些胚胎移植入受体羊子宫,成功地获得了1只存活的羔羊【10】,见图9。这是人类历史上的首个体细胞核移植克隆哺乳动物,科学家命名它为Dolly,其社会影响力巨大,也成为了家喻户晓的“明星”。
图9:1997年Ian Wilmut与Keith Campbell等在Nature上报道了利用成年绵羊乳腺母细胞核移植获得的克隆羊Dolly。
体细胞克隆哺乳动物俱乐部
1997~
自克隆羊Dolly诞生后,其他不同物种也被成功克隆,相继证实了体细胞核移植的可行性。截止目前,正式国际学术期刊报道的健康存活的体细胞克隆哺乳动物有以下19种:牛 (1998年)【11】、小鼠 (1998年)【12】、山羊 (1999年)【13】、猪 (2000年)【14】、欧洲盘羊 (2001年)【15】、家兔 (2002年)【16】、家猫 (2002年)【17】、马 (2003年)【18】、大鼠 (2003年)【19】、骡子 (2003年)【20】、非洲野猫 (2004年)【21】、狗 (2005年)【22】、雪貂 (2006年)【23】、狼 (2007年)【24】、水牛 (2007年)【25】、红鹿 (2007年)【26】、单峰骆驼 (2009年)【27】、以及最近的非人灵长类长尾猕猴 (2018年)【28】等,见图10。其中,水牛和猕猴完全由中国本土完成(分别为广西大学和中科院神经所),克隆大鼠和雪貂的主要完成人均为中国科学家 (论文第一作者),这说明我国在核移植研究领域处在国际领先地位。
图10:首次报道的体细胞克隆哺乳动物 (各动物照片均出自原始论文)。
从左往右、从上往下依次为:Dolly、牛、小鼠、山羊、猪、欧洲盘羊、家兔、家猫、非洲野猫、大鼠、雪貂、狗、狼、水牛、骡子、红鹿、单峰骆驼、马及长尾猕猴。
另外,有2个新的异种克隆物种存在异常,即克隆印度野牛【29】(家牛卵细胞,2000年) 与克隆双峰骆驼【30】(单峰骆驼卵细胞,2017年),前者在妊娠202天流产,后者在出生7天后死亡。
第一例冷冻死尸来源的克隆动物
2007,小鼠
2007年,日本科学家Teruhiko Wakayama(他首次报道获得了克隆小鼠【12】)等将完全没有冷冻保护剂的、-20℃冷藏16年的小鼠尸体成功地克隆复制【31】。在该项研究中,他们先尝试用死尸的各种不同组织分离的细胞核移植,发现只有大脑来源的细胞克隆胚胎体外发育和获得ESCs的效率最高。然后,再利用大脑细胞来源的核移植ESCs作为供体细胞核移植 (连续核移植),获得了4只克隆小鼠,其中2只具备正常生育功能,见图11。
这项突破性的研究给我们解答了以下重大问题:1. 长期冷藏的死亡个体即使其所有细胞也全部死亡,只要其遗传物质不降解,就可以被克隆复制。2. 为物种整个基因组的有效储存提供新的思路和方法;3. 为复活古生物提供思路和实验基础。