艾吉奥死里逃生但身负重伤。只得与家人逃亡意大利首都罗马，但波奇亚家族已然掌控罗马，此时的罗马百业萧条，市民被剥削而生活困苦。
艾吉奥一步步联结了罗马市内的妓女、盗贼和佣兵势力。招揽反抗的市民加入麾下，组成刺客兄弟会以求解放波奇亚控制下的罗马。
艾吉奥一方面在暗中积蓄实力，一方面打探西泽尔的情报。得知其财政由其兄长胡安·波奇亚负责，而西泽尔的野心也在逐渐发酵，他准备联合法国公爵路易十二的军事力量以及发明家达芬奇的战争机器以征服意大利。
在艾吉奥瓦解西泽尔的邪恶企图后，潜入梵蒂冈圣天使城堡。欲与教皇对质，以追问伊甸园金苹果的下落时，却得知教皇不满其子西泽尔的无穷野心，准备对其下毒。
西泽尔却先一步得知计划，反将教皇*死，并准备前往教堂得到金苹果。艾吉奥先人一步夺得金苹果，同时教皇儒略二世即位并下令追捕西泽尔。
1507年3月，艾吉奥追*西泽尔于西班牙维安纳并于围城战中与其决斗。在一番激烈的角斗后，西泽尔受伤，艾吉奥借势将其从城墙投下。在记忆结尾，艾吉奥将金苹果藏于罗马斗兽场的一个密室内。
戴斯蒙德回溯至现代前往斗兽场，打开密室后取得了金苹果，至此一代大师艾吉奥的传奇故事告一段落。
前往意大利最宏伟的城市——罗马，击倒敌人，建立属于自己的刺客工会。刺客信条剧情系列最为出色的便是艾吉奥三部曲，而其中兄弟会又是这三部曲中的巅峰之作。在本作极具特色的招募系统却没有延续下去，实在让人惋惜。
