基因工程难点总结,基因工程的现状及发展的收获

第一章 基因工程

第一节 基因工程概述

一．基因工程的概念

由于基因工程是在DNA分子水平上进行操作,因此又叫做*DNA技术。

二．基因工程的基本工具

（一）“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（简称限制酶）

1．来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。

2．功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两

个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。

3．结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。

（二）“分子针线”——DNA连接酶

1．分类：根据酶的来源不同，可分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类

2．功能：恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。

★两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶)的比较：

①相同点：都缝合磷酸二酯键

②区别：E．coIiDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能使黏性末端之间连接；

T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低。

★DNA连接酶与DNA聚合酶作用的比较

(三) “分子运输车”——载体

1.载体具备的条件：

①能在受体细胞中复制并稳定保存；

②具有一至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入；

③具有标记基因，供*DNA的鉴定和选择。

2.基因工程常用的载体有： 质粒 、 噬菌体 和 动、植物病毒 等。

最早应用的载体是质粒，它是细菌细胞中的一种很小的双链环状DNA分子。

三．基因工程的基本过程

(一) 获得目的基因（目的基因的获取）

1.获取方法主要有两种：①从自然界中已有的物种中分离出来，可从基因文库中获取。

②用人工的方法合成。

★获得原核细胞的目的基因可采取直接分离，获取真核细胞的目的基因一般是人工合成。

★人工合成基因的常用方法有反转录法和化学合成法。

2.利用PCR技术扩增目的基因

（1）PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。

（2）目的：获取大量的目的基因

（3）原理：DNA双链复制

（4）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链为单链；

第二步：冷却到55～60℃，引物与两条单链DNA结合；

第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成。

（5）特点：指数形式扩增

(二) 制备*DNA分子（基因表达载体的构建）

1．*DNA分子的组成：除了目的基因外，还必须有标记基因。

★标记基因的作用：鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。

2．方法：同种限制酶分别切割载体和目的基因，再用DNA连接酶把两者连接。

(三) 转化受体细胞（将目的基因导入受体细胞）

1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

2.常用的转化方法：

①将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌介导转化技术（农杆菌转化法），其次还有基因枪介导转化技术（基因枪法）和花粉管通道技术（花粉管通道法）。

②将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。

③将目的基因导入微生物细胞：Ca＋处理法。

(四) 筛选出获得目的基因的受体细胞、培养受体细胞并诱导目的基因的表达（目的基因的检测与鉴定）

1.首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。

2.其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是采用DNA分子杂交技术。

3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采用抗原—抗体杂交技术。

4.有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如抗虫或抗病的鉴定等。

第二节 基因工程的应用

1．运用基因工程改良动植物品种最突出的优点是：能打破常规育种难以突破的物种之间的界限。

2．基因工程的应用

（1）植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。

（2）动物基因工程：提高动物生长速度来提高产品产量、改善产品品质，用转基因动物生产药物，用转基因动物作器官移植的供体等。

（3）基因诊断和基因治疗：

基因诊断：又称为DNA诊断，是采用基因检测的方法来判断患者是否出现了基因异常或携带病

原体。

基因治疗：指利用正常基因置换或弥补缺陷基因的治疗方法。

实例：ADA基因缺陷症的基因治疗

第三节 蛋白质工程

1．蛋白质工程的实质：根据蛋白质的结构与功能之间的关系，通过改造基因，以定向改造天然蛋白质，甚至创造自然界不存在的、具有优良特性的蛋白质。

2．蛋白质工程的基本原理

预期蛋白质功能→测定蛋白质三维空间结构→推测应有的氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）→具有预期功能的蛋白质

3.蛋白质工程的应用

（1）通过改造酶的结构，有目的地提高蛋白质的热稳定性。

（2）合成嵌合抗体。

（3）改变蛋白质的活性。

★蛋白质工程与基因工程区别