图2 A，对黄花菜样品中1642种代谢物进行分类；B，PCA得分图；C，所有样品中所有代谢物的HCA结果。每个样品用一列表示，每个代谢物用一行表示。每个代谢物的丰度用特定颜色的条形图表示。上调和下调的代谢物分别用不同颜色的红色和绿色表示。
我们通过OPLS-DA来筛选各组之间差异的代谢物(图3)。R2X、R2Y、Q2等参数可评价OPLS-DA模型。其中，R2X和R2Y分别表示构建的OPLS-DA模型对X和Y矩阵的解释能力，Q2表示模型的预测能力。R2X和R2Y越接近1，说明模型越稳定可靠。当Q2 > 0.5时，可以认为是有效模型；如果Q2 > 0.9，可以认为这是一个优秀的模型。在本研究中，各比较组的Q2值都在0.9以上，说明OPLS-DA模型是稳定的。OPLS-DA图显示，4个产区的黄花菜是分开的，差异显著。DT vs YQ的R2X、R2Y、Q2分别为0.777、1、0.99；DT vs LL的R2X、R2Y、Q2分别为0.796、1、0.993；DT vs LF的R2X、R2Y、Q2分别为0.732、1、0.982(图3A、C、E)。总的来说， DT黄花菜中的代谢谱与YQ、LL和LF中的代谢谱不同。
图3 4个产地黄花菜的OPLS - DA得分图。A、C、E分别为DT vs YQ、DT vs LL、DT vs LL的OPLS - DA模型图；B、D、F分别为DT vs YQ、DT vs LL、DT vs LL的火山图。
我们在DT vs YQ中共鉴定出557种差异代谢物(FC > 1或< 0.5,VIP > 1)，其中315种代谢物上调，238种代谢物下调；在DT vs LL中有667种差异代谢物(281种上调，385种下调)；在DT vs LF中有359种差异代谢物(167种上调，192种下调)。这些差异代谢物中，氨基酸及其衍生物、类黄酮和酚酸所占比例最高(图3B、D、F)。韦恩图分析不仅可以显示每组代谢物的数量，还可以显示不同组之间代谢物的重叠关系。如图S2所示，4种样品中所有代谢物的数量不同。DT vs YQ、DT vs LL、DT vs LF中独有成分数量分别为184、243和59种。我们在3个比较组中检测到141种共有代谢物，包括8种生物碱、45种氨基酸及其衍生物、2种苯及其取代衍生物、28种黄酮类、5种木脂素和香豆素、6种脂类、2种核苷酸及其衍生物、9种有机酸、3种其他、28种酚酸、2种醌类、3种萜类成分(表S5)。此外，我们还调查了不同产地黄花菜中营养物质的含量比例，以及代谢产物中营养物质的含量。DT和YQ黄花菜中黄酮醇含量差异最大，说明YQ的气候条件有利于黄酮醇积累(图S3A - B)。DT和LL的黄花菜中氨基酸及其衍生物和LPC含量差异最大，表明DT的气候有利于氨基酸及其衍生物(图S3C - D)的形成。DT和LF组之间的差异相对较小，氨基酸、衍生物和黄酮类成分(图S3E - F)的含量变化显著。
6.KEGG注释和富集分析
6.1 DT vs YQ之间的差异代谢物
我们在DT和YQ之间鉴定了557种代谢物，包括29种生物碱、152种氨基酸及其衍生物、5种苯及其取代衍生物、114种黄酮类、15种木脂素和香豆素、56种脂类、25种核苷酸及其衍生物、25种有机酸、32种其他、79种酚酸、14种醌类、10种萜类、1种单宁(表S6)。我们进一步对DT和YQ比较组中的关键代谢通路和代谢物水平进行分析。差异代谢途径的P值越小，表明该富集途径越显著。黄酮和黄酮醇的生物合成、多种植物次生代谢物的生物合成和α-亚麻酸代谢途径是DT vs YQ中差异代谢物所富集到的三条途径， 有9、11和6种代谢物分别富集在三条途径上(图4A-C，表S9)，其中上调代谢物14种，下调代谢物12种。丰度差异(DA)评分可以反映通路的总体变化。当DA得分为1时，所有已识别通路的表达呈上升趋势，当DA得分为−1时，所有已识别通路的表达呈下降趋势。DA评分的绝对值用线段的长度表示，线段末端圆点的大小对应通路中差异表达代谢物的数量。代谢物越多，这些点就越明显。P值的大小由线段和点的颜色显示，越趋向红色，P值越小，越趋向紫色，P值越大。在本研究中，与DT相比，YQ中确定的黄酮和黄酮醇生物合成、多种植物次生代谢物生物合成和α -亚麻酸代谢三种途径均上调(图4D)。与前期研究一致，黄酮类化合物是黄花菜中最重要和最丰富的化合物之一。根据碳环的饱和度、取代程度和氧化程度，黄酮类化合物可分为不同的类别，主要分为黄烷酮、黄酮、异黄酮、黄烷醇、二氢黄酮醇、花青素、原花青素和橙酮类成分。如图5A所示，在黄酮和黄酮醇的生物合成中，DT黄花菜中的芹菜素 7-O-葡萄糖苷、阿福豆苷、异牡荆素、牡荆素、异槲皮素、山奈酚-3-O-sophorotriside、三叶豆苷的水平显著低于YQ。此外，有9种代谢物(邻羟基肉桂酸*、1-O-没食子酰-β-D-葡萄糖、氢化肉桂酸内酯、没食子酸、肉桂酸、烟酰胺、松柏醇、顺式香豆素酸-β-D-葡萄糖苷和磷酸烯醇式丙酮酸)参与了多种植物次生代谢物的生物合成；有5种代谢物(9-hydroperoxy-10E,12,15Z -十八碳三烯酸、13S -羟基- 9Z,11E,15Z -十八碳三烯酸、12-氧-植物二烯酸、茉莉酸和9-羟基- 10,12,15-十八碳三烯酸)参与α -亚麻酸代谢，这5种代谢物在YQ的含量高于DT(图5B-C)。
图4 A-C，比较组之间差异代谢物的KEGG富集（DT与YQ/LL/LF）。图中的每个气泡代表一条代谢途径，其横坐标和气泡大小一起表示该途径影响因子的大小。气泡尺寸越大，表明影响因子越大。气泡颜色代表富集分析的p值，颜色越红表示富集程度越高。D-F，不同比较组之间代谢途径的差异丰度 (DA) 评分（DT 与 YQ/LL/LF）。
图5 DT vs. YQ(A-C)、DT vs. LL(D-G)和DT vs. LF(H-I)关键差异代谢途径涉及的代谢物水平热图。
我们采用Pearson相关系数法计算差异代谢物与环境因素的关系(图S4A)。结果表明，上述代谢物水平与日平均温度和日最高温度、有效硒和有机质呈显著正相关，与海拔高度和有效钾呈显著负相关。两产地环境因子分析表明，DT的海拔高度和有效钾含量明显低于YQ地区。相比之下，YQ的日平均和最高温度、有效硒和有机质显著高于DT(表S1-2)。因此，YQ的环境更有利于黄花菜中上述差异代谢物的富集。
牡荆素和异牡荆素是许多中药的活性成分，存在于各种药用植物中。近年来，牡荆素因其广泛的药理作用，包括抗氧化、抗癌、抗炎、抗过敏和神经保护作用而受到越来越多的关注。异槲皮素可能是对抗链脲佐菌素诱导的神经毒性和阿尔茨海默病的有效候选治疗药物。
此外，黄酮类化合物和异黄酮可能有助于黄花菜的风味特征，如苦、酸或涩味的形成，黄酮类化合物的富集有助于黄花菜发挥生理功能，增强风味。此外，黄酮类化合物还具有抗抑郁、改善睡眠和促进哺乳的作用。虽然YQ黄花菜的TFC低于DT，但KEGG代谢途径中富集的类黄酮代谢物含量高于DT。此外，植物次生代谢物显著促进植物的生存，并与其他物种建立生态联系。次生代谢物有助于保护植物免受病原攻击和环境胁迫。在植物中，α -亚麻酸调节免疫功能。因此，YQ黄花菜中上述代谢物的富集可能促使其具有良好的生理功能和应对环境胁迫的特性。
6.2 DT vs LL之间的差异代谢物
我们在DT vs LL中共鉴定出667种代谢物，包括39种生物碱、242种氨基酸及其衍生物、4种苯及其取代衍生物、89种黄酮类、20种木脂素和香豆素、88种脂类、24种核苷酸及其衍生物、26种有机酸、35种其他酸、77种酚酸、14种醌类、8种萜类、1种单宁(表S7)。DT vs LL的差异代谢物主要富集在鞘脂代谢、异喹啉生物碱生物合成、色氨酸代谢、青霉素和头孢菌素生物合成途径，5、4、9和3种代谢物分别富集在这4条通路上，其中上调代谢物12种，下调代谢物9种(图4B，表S9)。DA评分图显示，与DT相比，LL中所有四条通路均下调(图4E)。在本研究中，参与鞘脂通路的代谢物(如鞘氨醇及其衍生物和1-磷酸-神经鞘氨醇衍生物)和参与青霉素和头孢菌素生物合成的代谢物(如半胱氨酸和缬氨酸)水平在DT中明显高于LL (图5D-E)。此外，色氨酸途径上的代谢物和异喹啉生物碱生物合成中的3种代谢物水平在DT中高于LL(图5F-G)。
差异代谢物与环境因素的相关性分析(图S4B)表明，除DL-2-Aminoapic acid、L-半胱氨酸和对羟基苯乙胺外，LL 和DT黄花菜差异代谢物水平与海拔高度、日平均和最高温度、有效钾、有效硒和有机质呈负相关。LL的土壤养分(有效钾、有效硒和有机质)和气候因子(海拔、日平均和最高温度)均高于DT(表S1-2)。因此，与DT相比，环境因素导致LL地区黄花菜代谢产物的积累较少。
鞘脂参与调节植物的发育、对刺激的感知和对胁迫的反应。此外，鞘脂类成分是在所有植物物种中发现的必需代谢物，它们可以维持质膜完整性，提高耐受性和响应生物和非生物胁迫，以及充当细胞内信号分子。因此，鞘脂代谢对植物生长代谢至关重要。在植物中，1-磷酸鞘氨醇(一种鞘氨醇衍生物)已被证明通过脱落酸信号通路影响气孔开放。游离鞘脂类成分，包括鞘氨醇，一直是信号分子，充当调节应激反应的第二信使。此外，半胱氨酸有助于甘氨酸和谷氨酸合成谷胱甘肽，是蛋白质合成的基本氨基酸。谷胱甘肽是植物中重要的抗氧化剂。对于乳腺和卵巢来说，缬氨酸是一种关键的生长因子，它对于预防神经和消化系统疾病至关重要。L-色氨酸是蛋白质生物合成所必需的氨基酸，对哺乳动物的生理机能有重要影响，包括胃肠功能、免疫、代谢和神经系统。色氨酸代谢被发现在睡眠障碍中发生改变。此外，植物中的色胺是诱导吲哚类生物碱(如长春新碱和长春碱)合成途径的前体,这些吲哚类生物碱对人体健康很重要。色胺衍生物如5-羟色胺可能参与许多过程，包括保护活性氧和生物/非生物胁迫反应。异喹啉生物碱具有多种药用特性，包括抗病毒、抗真菌、抗癌、抗氧化、抗惊厥和酶抑制。与LL相比，DT黄花菜在促进睡眠、对抗环境胁迫和应激以及发挥生理作用方面作用更强。
6.3 DT vs LF之间的差异代谢物
如表S8所示，我们在DT vs LF中共鉴定出359种代谢物，包括20种生物碱、105种氨基酸及其衍生物、2种苯及其取代衍生物、60种黄酮类、13种木脂素和香豆素、29种脂类、10种核苷酸及其衍生物、18种有机酸、25种其他、62种酚酸、11种醌类、4种萜类。然后我们进行KEGG富集分析，结果显示在DT vs LF的差异代谢物中，7种代谢物富集在苯丙素生物合成途径上，5种代谢物富集在戊糖和葡萄糖醛酸转化途径上，(图4C，表S9)，其中有9种代谢物上调，3种代谢物下调。DA评分图显示，与DT相比，LF中两条通路均上调(图4F)。在本研究中，戊糖和葡萄糖醛酸转化途径上的5种代谢物中有3种，苯丙素生物合成通路上的7种代谢物中有6种(即咖啡酸、紫丁香苷)代谢物的含量在LF中高于DT(图5H- I)。
如图S4C所示，除阿魏酸、木糖醇、D-阿拉伯糖醇外，DT和LF黄花菜中差异代谢物与日平均气温和最高气温呈正相关，与海拔、有效钾、有机质呈负相关。LF中海拔高度和土壤养分(有效钾和有机质)均显著低于DT (表S2)。LF的日平均气温和最高气温均高于DT。因此，LF环境更有利于黄花菜中上述差异代谢物的富集。
苯丙素对植物生长发育和对环境刺激的响应至关重要，例如，对非生物/生物胁迫的耐受性和抗性，苯丙素代谢途径在许多化合物的生物合成中起着至关重要的作用，包括黄酮类化合物(花青素、黄酮醇等)、木质素、香豆素和木脂素。此外，几种苯丙素类化合物可以作为有效的抗氧化剂。咖啡酸(CA)是羟基肉桂酸的主要成分，具有抗氧化、抗癌、降糖、降压、抗菌、保肝、抗病毒等功能。它们存在于大多数植物药中。紫丁香苷具有抗炎和抗氧化作用。当植物面临环境胁迫时，戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化增强，促进碳水化合物和能量代谢，诱导次生代谢物的合成。也就是说，与DT黄花菜相比，LF黄花菜对非生物和生物胁迫的耐受性更好，生理活性也更好。
结论
本研究对不同产地黄花菜的蛋白质、TPCs、TFCs和氨基酸含量进行了研究。DT黄花菜中蛋白质和氨基酸含量最低，水分和TPCs含量最高。蛋白质和氨基酸含量以YQ最高，鲜味和甜味氨基酸含量也以YQ最高，TFC含量以YQ 最高。我们利用RDA分析找出影响不同地区黄花菜营养成分差异的关键环境因子：海拔和温度，采用超高效液相色谱-质谱联用系统对不同产地黄花菜代谢产物进行了定性和定量分析。我们在黄花菜共检出1672种代谢物，其中氨基酸及其衍生物含量最高，其次为黄酮类、酚酸类和脂类。通过PCA和OPLS-DA得分图观察DT与YQ、LL、LF之间代谢物积累的显著差异。DT与YQ、LL和LF的差异代谢物分别有557、667和359种。我们还分析了DT与YQ、LL和LF之间代谢途径和代谢物的差异。DT和LL之间KEGG代谢途径(鞘脂代谢、异喹啉生物碱生物合成、色氨酸代谢、青霉素和头孢菌素生物合成途径)下调，DT和YQ(黄酮和黄酮醇的生物合成，多种植物次生代谢物的生物合成，以及α-亚麻酸代谢)，DT和LF(酚类化合物的生物合成，戊糖和葡萄糖醛酸转化途径)之间的差异代谢途径上调，表明YQ和LF黄花菜可能具有更好的非生物和生物胁迫耐受性和生理活性。因此，YQ和LF地区也适合种植高营养价值的黄花菜。
本研究综合测定了黄花菜的营养成分和代谢产物，并从关键环境因子的角度分析了山西不同地区黄花菜营养成分和功能成分的差异。研究结果为开发黄花菜功能性食品提供了重要依据。
