2020年3月28日，中国慢淋学院网络公开课第四期开讲，南京医科大学附属第一医院（江苏省人民医院）李建勇教授和徐卫教授作为主席，南京医科大学附属第一医院（江苏省人民医院）王蓉老师、吴雨洁老师、仇海荣老师、乔纯老师分别分享《免疫组织化学技术》、《流式细胞学诊断》、《细胞/分子遗传学：核型分析与FISH》、《TP53/IGHV检测》，现将课程的精彩内容整理如下，以供广大医生朋友交流学习。
慢性淋巴细胞白血病在外周血中表现为小B淋巴细胞＞5×109/L，细胞质少、核致密、核仁不明显、染色质部分聚集，并易见涂抹细胞，外周血淋巴细胞中不典型淋巴细胞及幼淋巴细胞＜55%。CLL在骨髓中浸润方式有间质浸润、结节样浸润、混合（间质及结节样浸润）和弥漫性浸润。
免疫组织化学技术
01 免疫组化用于CLL诊断及鉴别诊断
小B细胞淋巴瘤种类很多，主要包括慢淋/小淋巴细胞淋巴瘤（CLL/SLL）、套细胞淋巴瘤（MCL）、边缘区淋巴瘤（MZL）、毛细胞白血病（HCL）、淋巴浆细胞淋巴瘤（LPL）、粘膜相关淋巴瘤（MALT）、滤泡性淋巴瘤（FL），仅依靠细胞形态和骨髓浸润方式，容易造成诊断困难、误诊、鉴别困难。因此，需要免疫组化技术对细胞进行定性，判断细胞来源。
CLL做免疫组化必选CD3、CD5、CD10、CD20、PAX5、CD23、LEF1、CyclinD1、SOX11、CD38、CD138，可选BCL-2、Ki-67、AnnexinA1、CD103等。鉴别诊断时以CD5作为切点，CD5 的患者做CD23，CD23 患者，做LEF1，如果LEF1 ，则诊断为CLL；CD23-患者做CyclinD1、t(11;14)，如果CyclinD1 、t(11;14) ，则诊断为MCL；如果CyclinD1-、t(11;14)-，但是SOX11 ，则诊断为MCL。
免疫组化技术的结果判定一般是白血病分型以阳性细胞占有核细胞≥30%为阳性，DAB强阳性为棕褐色，弱阳性为浅黄色（半定量），而骨髓转移瘤则不需计算阳性率，只要有明确的CK阳性细胞就可确定为转移癌。
02 免疫组化用于指导CLL治疗及判断CLL转化
由于正常患者中亦有淋巴小结，故治疗之后需要做淋巴小结的免疫组化来判定淋巴小结的是否为B细胞性淋巴小结，一般选择CD3、CD5、CD20、PAX5、CD23、LEF1等。
CLL还会向弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）（2-8%）和霍奇金淋巴瘤（HL）（＜1%）转化，向DLBCL转化时，细胞形态有两种形式，一是在小细胞的背景下出现大细胞，核仁明显，核染色质疏松；二是表现为没有小细胞，全部为大细胞。向HL转化时，表现为在小细胞背景下出现大细胞（经典R-S细胞），免疫组化可以帮助判断转化类型是DLBCL还是HL。
CLL的流式检测
01 FCM诊断CLL
通过流式细胞仪检查细胞表面抗原表达特点和B细胞的克隆性。正常B细胞κ和λ的比值大概是1.5:1；如果是慢性B淋巴细胞增殖性疾病（BCLPD），则轻链限制性表达，比值大于3:1或小于0.3:1，也有25%CLL轻链阴性。
CLL典型的免疫特征是CD19 CD5 CD23 ，轻链单克隆-dim ，FMC7-negative，CD20、CD22、CD79b dim to negative，CyclinD1-，SOX11-。非典型免疫表型CLL(aCLL)免疫特征表现为CD5-/CD23-/FMC7 /sIg (强) /CD79b (强)。CD200在CLL中强表达，在MCL中阴性；CD160在CLL中高表达（98%），但在MCL中低表达，在HCL中强表达（100%），在其他BCLPD中低表达；CD11C在CLL中高表达，在MCL中低表达；CD43在CLL中高表达，在MCL中低表达，在MZL中多数不表达；CD81在正常B淋巴细胞高表达，CLL中不表达或弱表达。这些都可以用于CLL和其他B-CLPD的鉴别诊断。
02 FCM监测CLL-MRD
FCM检测CLL-MRD样本来源主要是骨髓和外周血。骨髓检出率高，阴性预测值 (NPV)更有意义。外周血检出率低于骨髓，但对于高危患者能否在巩固或维持治疗中获益，阳性预测值(PPV)更有意义。CD19/CD20、CD5/CD19、CD19/CD5/CD20、κ/λ/CD19、κ/λ/CD19/CD45都不适合做CLL-MRD检测方案，四色单管标准方案——κ/λ/CD5/CD19，简单易行，适合于CLL细胞比例较高的样本，但阴性预测值 (NPV)较高，对于CLL-MRD比例低的患者易漏检。现多用八色以上的单管标准化方案，如采集细胞总数达到2×106，敏感性可达到10-5。
CLL的核型分析与FISH检测
iwCLL指南推荐外周血FISH检测的探针是del(13q); del(11q); del(17p), add12，核型检测亦推荐使用外周血，在实际临床中推荐的探针组合是P53/del(17p)、ATM/del(11q)、D13S319/del(13q)、CEP12，与MCL鉴别时用IGH/CCND1；选做项目有IGH、D13S25/del(13q)、RB1/del(13q)、MYB/del(6q)。
基因芯片可以发现多种FISH检查以外的染色体异常，其中8q-/9p-/18p-与不良预后相关，≥5 CNAs拷贝数变化是独立的预后不良因素，是CLL风险分层的重要手段。
此外，核型和FISH的联合评估可以提高检出率。间期FISH异常细胞比例> 85％13q-的患者的治疗等待期（TTFT）显著缩短，具有≤ 20％17p- 患者的中位TTFT和OS更长，具有 > 60%的12号染色体三体患者TTFT 明显较短。新药的广泛使用让传统治疗下预后不良的患者生存得到不同程度的改善。复杂核型异常（Complex Karyotype, CK），对CLL患者预后的影响具有异质性：CK≥5时为独立的预后不良因素；CK≥3或CK≥4时，只有与p53异常（p53缺失或突变）同时存在时才是预后不良因素。
