2 药理学与毒理学
ASs具有很广泛的效应，如性激素（雄激素、雌激素、孕激素）既具有维持第二性征活性，又具有同化作用，本部分主要讨论其同化活性。ASs与非甾类雌性激素具有相似的同化活性，主要表现为:同化代谢；肌肉/脂肪比率增加；提高基础代谢，改善饲料转化率；抑制异化代谢作用，减少物质消耗；刺激促红细胞生成素生成，或直接作用于骨髓造血系统使红细胞生成增加；在骨骼肌细胞中已发现雄激素、雌激素和糖皮质激素受体，表明ASs可能直接作用于肌细胞导致肌肉增生。雌激素和孕激素还可通过抑制发情和避孕，增加食欲，以达到增重的目的。ASs的促生长效果对反刍动物最为显著，促进生长幅度达10%～40%，因此在养牛业中被大量应用。ASs可供注射或口服，但通常作为埋植剂使用，如以硅橡胶作为支撑材料，耳根部皮下埋植，ASs可持续释出。
同化激素类物质在细胞内具有专一性受体，很小的剂量即能产生作用，故同化激素用量极小（牛的使用剂量一般仅为每头几十至数百毫克），代谢和消除速度迅速，且体内代谢产物复杂。ASs口服易吸收，吸收后与血浆中的运输蛋白结合，如性激素结合球蛋白、皮质激素传递蛋白等，仅游离的ASs发挥药效。在可食性动物组织中，以肝、肾和脂肪中残留量较高，肌肉和血浆较低。孕酮在脂肪中浓度最高。肝、肾组织中以代谢物为主，肌肉、血浆中以原药为主。
同化激素的主要毒副作用是干扰人体正常的激素平衡，男性出现睾丸萎缩、胸部扩大、早秃和肝、肾功能障碍或肝肿瘤，女性出现雄性化、月经失调、肌肉增生、毛发增多等。长期摄入雌激素会导致女性化、性早熟、抑制骨骼和精子发育，特别是雌激素类物质具有明显的致癌效应，可导致女性及其女性后代生殖器官畸形和癌变，对于儿童则更明显。
同化激素类物质由于水溶性较差，性质稳定，容易在水底淤泥或土壤中富集并长期存在，故其对生态环境的影响越来越引起人们的广泛关注。ASs主要通过人及养殖场动物的排泄物进入环境，也有少部分来自工业和农业的化学污染物。ASs中的雌激素类物质是重要的环境激素污染物，包括雌激素和具有雌激素效应的物质，这些激素污染物不但影响人类健康，而且具有生态毒性，容易在鱼体内浓缩，干扰鱼类正常内分泌，从而对鱼类产生毒害作用，如导致雄鱼的雌性化、生殖器官畸形等。雌二醇和炔雌醇是污水中主要的雌激素物质。目前，已有报道指出约有ng/L数量级的环境雌激素存在于环境水体中，而相关研究表明，水体中1ng/L的雌二醇或炔雌醇即能诱导雄鱼体内合成卵黄红素（vitellogenin，一种存在于性成熟雌鱼体内的卵黄蛋白前体）；1ng/mL的雌二醇、炔雌醇或己烯雌酚可导致雄日本青鳉两性化，5～10ng/mL则完全雌性化（性别逆转）。
此外，一些释放到环境中的污染物能够干扰人类和动物激素调节的生理过程，改变内分泌与生殖系统的正常功能，对整个生态环境构成巨大威胁，这类化合物统称为环境内分泌干扰物。如环境中广泛存在的滴滴涕及其代谢物、十氯酮、多氯联苯、氯代二英和烷基酚类物质均具有雌激素效应。一些植物成分如三叶草中的金雀异黄素、豆科植物中的香豆雌酚亦具有一定的雌激素活性。
3 国内外限量要求
目前，各国对同化激素的使用还存在一些争议，因此对同化激素的MRL要求不尽相同，其主要的争端是在以美国、加拿大为代表的国家和欧盟之间。美国和加拿大认为在养牛业中使用同化激素是安全的，并且指责欧盟的要求缺乏科学的依据。加拿大卫生部的食品安全部门批准使用天然的激素如雌二醇、孕酮、睾酮和合成激素如群勃龙在养殖业中使用，可以单独或复合的用于动物耳部的包埋；美国批准雌二醇、苯甲酸雌二醇、丙酸睾酮、孕酮、群勃龙乙酸酯在动物饲养中使用。而欧盟从1988年起就禁止所有同化激素用于动物饲养，但各成员国可以授权使用睾酮、孕酮及其衍生物用于治疗目的，但也有严格的规定，必须由兽医专门注射，同时还必须登记、注册。我国于20世纪90年代起禁止将ASs用于促生长目的，农业部176公告已明确规定禁止使用己烯雌酚、炔诺酮、苯丙酸诺龙等ASs，并开始着手开展相关的监测工作。CAC、美国、欧盟、中国和日本对动物源性食品中同化激素MRL的要求见表5-50。
欧盟禁止使用的同化激素清单：二苯乙烯类及其衍生物（如己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚等）；雌激素类（雌二醇、雌三醇、雌酮等）；雄激素类（睾酮、诺龙、甲基睾酮、氯睾酮、康力龙、玉米赤霉醇等）；孕激素类（甲地孕酮、甲羟孕酮、美仑孕酮等）。我国农业部规定的禁止使用的同化激素类药物清单:己烯雌酚及其盐和酯、甲基睾酮、丙酸睾酮、苯丙酸诺龙、苯甲酸雌二醇及其盐和酯；具有雌激素样作用的物质（玉米赤霉醇、群勃龙、醋酸甲羟孕酮及制剂）。
4 样品处理方法
样品前处理步骤一般包括提取、净化、衍生化等。提取过程中，根据样品基质的差异决定是否需要水解基质以释放药物；由于ASs残留水平低，内源性干扰物质多，对净化的效果要求较高，常见两种或两种以上萃取方法联用以达到分析要求；对于气相方法多需要衍生化，而液相分析方法则通常无须衍生化，前处理步骤相对气相方法而言较为简单。
对于多数ASs来说，较为通用的样品前处理过程如下:水解蛋白质→水解轭合物→LLE→SPE（C18、XAD、硅胶或/和IAC）→HPLC→衍生化。
ASs残留的分析样品主要包括尿液、血清（或血浆）、奶、蛋、肝脏、胆汁、肾脏、肌肉、脂肪、毛发、粪便、土壤、水、河床中的泥沙等。
4.1 样品的提取
由于样品性质不同，提取方式相差较大。对于液体样品，需要预先进行稀释、调节pH等；半固体及固体样品需要预先与水或缓冲溶液均质后，加入碱液或缓冲溶液水解样品使共轭的药物解离后，通常再用酶进一步水解以充分释放药物。枯草杆菌蛋白酶、葡糖-硫酸酶和β-葡萄糖苷酸酶是ASs样品处理中常用的3种水解酶。葡糖-硫酸酶的一般水解条件为:37℃，pH5.2，2h。枯草杆菌蛋白酶一般水解条件为:60℃，pH9.5，3.5h。β-葡萄糖苷酸酶多用于液体样品的分析检测中，通常在加入酶之前需要调节适当的pH，当然，β-葡萄糖苷酸酶在某些半固体或固体样品中也有应用。ASs的硫酸轭合物通常不能被芳基硫酸酶完全水解，需进一步酸解。如将酶解样品液酸化，乙酸乙酯提取，提取液在40℃下静置1h（酸解），残余的酸用碱性溶液洗涤除去。
酶解后的样品液通常在一定的pH条件下用单一有机溶剂（如乙腈、甲醇、丙酮、二氯甲烷、叔丁基甲醚、乙醚、氯仿等）或多种有机溶剂混用（如水-丙酮、氯仿-甲醇等）来进行提取，当然也有些方法直接使用C18、XAD-2（一种大孔聚苯乙烯填料）等反相SPE或IAC柱净化而省略提取步骤。
4.2 样品的净化
4.2.1 LLE
因为 ASs极性较弱,所以常在甲醇、乙腈等提取液中加入弱极性或中等极性的萃取溶剂如乙醚、叔丁基甲醚（TBME）、氯仿、二氯甲烷和乙酸乙酯等。近年来的文献中TBME使用频率较高。
在20世纪90年代的研究中，一种被称为三相LLE系统的萃取体系被广泛用于ASs净化:用乙腈提取样品；向提取液中加入10mL正己烷-二氯甲烷（8∶2）；振荡萃取，静置后形成正己烷（上）-乙腈＋二氯甲烷（中）-水（下）三相体系；移取中间层（含ASs）浓缩后做进一步净化或测定。近年来文献中也常报道采用这种三相萃取体系，以达到净化目的。
对于某些含酚羟基的激素（如DES、己烷雌酚等）可以通过调节溶液的pH而使药物在水相和有机相之间进行分配，以达到除去某些脂溶性杂质的目的。此外，对于某些水溶性杂质，可采用萃取前酸化或碱化样品液或萃取后用碱性或酸性水溶液洗涤的方法除去，这种净化方法适用于绝大多数ASs。
LLE是一种初级的净化技术，但通过多相分配体系可以较大程度地去除脂肪、蛋白质等杂质的干扰，有利于提高方法的灵敏度。
4.2.2 SPE
由于具有成本低、可操作性强、易于处理高通量样品等优点，加之SPE柱的种类越来越丰富，SPE已经成为当今最为常用的样品净化手段。
常用的反相填料有 C18、C8、聚苯乙烯类型的高分子填料柱 (如HLB)；正相填料有硅胶、氧化铝、硅藻土、Florisil、Sephadex-LH-20等。反相柱主要用于富集脂溶性的ASs和除去水溶性或高极性杂质，而正相柱多用于脱脂和除去强极性杂质。在实际过程中，常将不同类型的SPE柱联合使用（正相柱、反相柱和/或IAC柱）。
4.2.3 免疫亲和萃取
利用免疫反应原理，通过制备出单克隆抗体或多克隆抗体，选择性地吸附样品中的抗原物质（即目标激素）。由于抗原抗体反应的高特异性、高灵敏度、高选择性等特点，免疫亲和萃取无论在净化效果还是操作过程的简化方面都优于传统的SPE。但抗体的制备较为繁琐，且一般只能用于单一组分或特定类别的ASs净化。
4.2.4分子印迹技术
分子印迹是能够制备出对目标分子具有特定识别能力的聚合物材料。分子印迹聚合物又称模拟受体，制备方法比较简单，性质比较稳定，可重复多次使用，是一种发展前景较好的新型仿生材料。如Jiang等制备出针对17β-ES的分子印迹聚合物，并成功应用到鱼体内17β-ES的残留检测方法中。
4.2.5 超临界流体萃取（SFE）
SFE是一种样品制备技术。超临界流体的性质介于气体与液体之间，既有液体的高密度又有气体的高扩散性，能够渗透到固体内部溶解被测组分。SFE具有样品加工方便快速、有机溶剂消耗极小、易于控制且可与色谱-质谱检测器联用的特点。无毒、无污染且有化学惰性的二氧化碳是常用的超临界流体，它特别适用于萃取极性较弱的脂溶性物质，因而超临界二氧化碳对ASs有相当好的溶解性。但超临界二氧化碳对弱极性、脂溶性物质的良好溶解性也使得萃取过程中残留较多的脂溶性杂质，从而干扰衍生化和测定过程。当然，作为常规SPE的一种补充手段，有文献报道在SFE萃取池尾端串联氧化铝SPE柱，萃取后再将吸附在氧化铝柱上的待测物洗脱下来进行检测分析。
4.2.6 LC分离净化技术
相对于SPE柱和免疫亲和色谱柱的净化效果，LC具有更好的选择性、分辨率和重复性。一般使用反相的色谱系统，在适当的时间内收集流出组分，浓缩后进行衍生化和测定。但使用缺陷为收集液中含水量高、不易浓缩。VanGinkel等曾用不同的方法（SPE、IAC）净化牛尿液中的β-NT及其代谢物α-NT。
5 检测方法
5.1 HPLC法和LC-MS法
近年来，MS检测器等高灵敏性检测器的发展、普及使得HPLC技术的分离和检测能力得到显著提高，也改变了过去行业中以GC-MS作为检测ASs主要手段的局面。HPLC可直接分离ASs、无须衍生化、柱效高、载样量大，特别是在MS检测器的配合下，解决了过去难以利用HPLC同时分析多类别ASs的问题。表5-51列出的是近年来已报道的ASs残留检测的HPLC方法。
然而随着科技的不断进步及科研实践中对检测方法的灵敏度要求越来越高，普通的HPLC仪器正逐步地被LC串联一级MS（或多级MS）、UPLC串联一级MS（或多级MS）等替代。MS检测器凭借其独特的检测碎片离子的原理和更高的灵敏度成为当前科研实践中较为常见的检测手段。表5-52列出的是利用MS作为检测器的ASs残留检测方法。
