②加样: 每根反应管中加入核酸或对照各5uL，盖紧管盖或封好透明膜，置于荧光定量PCR检测仪上。
③扩增条件设定：
④仪器检测通道选择:使用荧光定量PCR检测仪，选择Fam荧光信号检测通道，收集设在60℃。具体设置方法参照各仪器使用说明书。
⑤结果分析阈值设定:使用荧光定量PCR检测仪进行结果分析时，基线取3-10或6-15个循环的荧光信号，阈值设定原则为阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线最高点，也可根据仪器噪音情况调整阈值。
（3）核酸检测结果判断
①Real-time PCR反应系统的质量控制:反应结果应同时符合以下2个条件，否则试验结果无效，应重新开展检测。阴性对照无扩增，为阴性。阳性对照未出现阴性结果。
②结果判定：
A.阴性：双孔Ct值＞37，或无Ct值；
B.灰区：一孔Ct值＞37；
C.阳性：双孔Ct值＜37。
所有阳性和处于灰区的标本应重复检测或经序列分析进行确诊。需注意：当标本仅为咽拭子或血清、血浆，且检测结果为阴性时，应结合临床症状，慎重做出阴性诊断。
（4）表格记录
做好荧光定量实时PCR方法检测猴痘病毒核酸原始记录。
五、猴痘病毒全基因组测序
1.测序标本选取原则。本土疫情中的首发或早期病例、与早期病例有流行病学关联的关键病例、感染来源不明的本土病例、境外输入病例阳性标本等。以上标本在核酸荧光定量PCR检测Ct值≤32时进行测序（关键样本除外）。
2.测序要求。以省为单位确定开展猴痘病毒全基因组测序的机构。建议使用扩增子技术进行猴痘病毒全基因组测序。测序数据经质控合格后方可用于后续生物信息分析。二代测序平台覆盖深度应不低于10×，三代测序平台覆盖深度应不低于50×，全基因组测序覆盖度应不低于98%。数据比对分析推荐参考猴痘基因组NC_063383.1。
各省应建立本省输入、本土病例猴痘病毒基因组数据库，应具备序列对比分析能力。具备测序条件的省份要在接收标本后48小时内开展测序工作，关键样本要求实验室收到标本后1周内提供测序结果报告，所有测序原始数据(一般为fastq格式)、组装序列（一般为fasta格式）和标本序列测定结果报告单（见附件7-2）应在获得序列48小时内报送中国疾控中心病毒病所进行序列汇总、分析。病毒病所应将序列分析结果及时反馈各省，并将全国猴痘病毒序列汇总、分析结果及时上报国家疾控局。
3.分子分型。推荐使用在线分析工具Nextclade（https:// clades.nextstrain.org）对变异株进行分子分型。
附件：
7-1猴痘病毒检测标本送检表
7-2猴痘病毒标本序列测定结果报告单
转自：国家疾控局微信公众号
来源： 健康报
