感染性疾病是指细菌、病毒、真菌、非典型病原体、寄生虫等及其产物所引起的局部或全身性炎症或器官功能障碍，具有很大的危害性和很高的病死率，是当今世界严重威胁人类健康的常见疾病。
病原微生物检测是诊断感染性疾病的重要方法，同时对治疗方案具有非常重要的指导意义。近些年新兴的宏基因组学第二代测序（mNGS）检测方法有力提高了检出率和弥补了传统检测方法的不足，但与之同时，mNGS在实际应用中也存在被过度夸大和神化的现象，这源自于太多人对mNGS的一知半解，愿此文能帮助大家提高对mNGS的认识和正确应用。
作者：王生成 海南医学院附属儋州市人民医院感染科
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1 mNGS较传统病原学检测方法的优势
传统的病原微生物鉴定方法主要有涂片镜检、分离培养、生化反应和质谱等方法，但其存在周期长、过程复杂及灵敏度低等缺点，在敏感性、特异性、时效性、信息量等方面存在局限，如分枝杆菌菌种鉴定需要长达30～40天的时间，而一些苛养菌及病毒对培养条件要求极其苛刻，甚至不能培养，而且对于未知或者罕见的病原微生物无法快速识别。据统计，约70%的感染性疾病患者因传统检测方法无法确定病原体信息，不能得到及时有效地救治，从而使病情恶化。
宏基因组学第二代测序（mNGS）则无需对病原体进行分离培养，也不依赖已知核酸序列，可直接快速客观地对临床样本中的较多病原微生物（包括病毒，细菌，真菌，寄生虫）进行测序鉴别，且无需特异性扩增，大大节省了检测时间，提高了诊断效率，在对未知物种及难以培养的病原体鉴定方面更是具有无可比拟的优势。
传统的分离培养方法通常只能培养出一种微生物，当存在混合菌（包括混合不同类型微生物）感染时通常会漏检，当定植菌超过致病菌的载量时，通常只培养出定植菌而造成漏检和误导临床，而mNGS可以检测出多种微生物（包括混合菌和不同类型的微生物）。
因此，快速、特异且高通量的病原体检测方法（mNGS），对有效诊断和及时防治感染性疾病具有重要的意义，尤其是目前全球感染性疾病的发病率继续有所上升，病原体呈现多样化和复杂化的发展趋势下，mNGS受到了极大的推广和热捧。
2 mNGS的重要不足。
从上述内容来看，mNGS是非常好的技术和检测方法，而且较传统检测方法具有明显优势，笔者怎么认为它是被过度夸大和神化了呢？
首先我们要明白之所以要做病原学检测的最主要原因和最终目的是什么？就是为了找到致病原，以及了解它对哪些药物敏感，对哪些药物耐药，以帮助我们更精准地选用药物和评估病情及预后。
不少人误以为mNGS无所不能，以为有了mNGS就可以找到致病原和知道选用什么抗感染药了，这种神化其实是对mNGS不了解而盲目产生的“不明觉厉”——事实上，很遗憾，mNGS只能检出包括寄生菌、定植菌、背景菌和致病菌等一大堆微生物，但不能直接告诉你哪个才是致病原，更没有药敏结果，不能告诉你对哪个药物敏感、对哪个药物耐药，所以不能盲目和过于依赖它，而且它价格不菲（至少是数千元），尤其是该检测项目在很多地区需要自费，医保不报销，对普通老百姓来说，这金额是很大的数目和负担。
3 如何正确应用mNGS？
mNGS不能直接告诉我们哪个才是致病原，也不能告诉我们它对什么药物敏感、对什么药物耐药，脱离了临床，花费上万元的mNGS检测结果就是一张废纸——但mNGS也绝不是一无是处，在关键时候它可能起到非常重要的关键作用，甚至是挽救生命的“最后一根稻草”，所以我们要学会正确应用。
相较于传统病原学检测方法，mNGS具有很多优势，但同时也存在一些重要（甚至是关键）的不足，因此，需要注意以下事项和有关专家共识推荐意见：
①mNGS不能完全取代常规的病原学检测项目，需要与传统方法联合使用以提高病原体诊断的敏感性和特异性。
②因为mNGS的高昂检测费用和自身存在的缺点，不能作为轻症感染性疾病的一线检测手段，更不能作为首选。
③对于局灶性感染的患者，应先完成常规感染指标和传统病原学检测，若仍未能获取病原学诊断结果，且临床治疗效果差，mNGS可作为二线首选检测手段。
④对于呼吸道感染患者，如果3 天内仍没有能够通过传统实验室检查获得明确的病原学依据且经验性抗感染治疗无效，可推荐留取呼吸道标本进行mNGS。
⑤对于脓毒症患者，推荐联合采用传统实验室培养和mNGS来提高病原学的检出率。
⑥对于高度怀疑病毒性肺炎且病情持续进展的患者，可先完善呼吸道病毒多重PCR检测，若为阴性，再行mNGS，并应同时进行核酸RNA反转录。
⑦对于新发、罕见、疑难感染性疾病以及免疫缺陷患者，mNGS能显著提高病原体的检出率，因此mNGS可作为上述疾病的一线检测手段。
⑧对于临床疑似（和支持）感染的病重、病危或免疫抑制、免疫缺陷患者，因为及早明确病原学结果极为重要，建议在完善传统实验室及分子生物学检测的同时，采集疑似（和支持）感染部位的标本进行mNGS。
4 解读mNGS结果时，要注意什么？
正确解读检测结果是正确指导临床的重要前提，mNGS并非是无所不能，它存在很多局限性和影响因素，因此在面对mNGS结果时，应与患者临床表现及实验室检查密切结合的前提下进行解读和验证，特别是要注意以下知识点：
①mNGS检出的病原体只能代表标本中存在这些检出微生物，但不能确定是定植菌、试剂工程菌、背景菌还是致病菌，因此要了解标本所采集部位的正常微生态菌群，以及可能的条件致病菌、定植菌，同时也要注意排除试剂工程菌与背景菌。
②不能单凭mNGS直接判定有无感染及其致病原，需要结合临床资料，如现症状体征、常用的感染指标（如血常规、C反应蛋白、降钙素原、血沉等）及影像学有无感染依据。
③对于局灶脓肿或组织感染患者，mNGS的总体灵敏性和特异性均较好，其中对细菌检测的灵敏性优于真菌。
④对于呼吸道感染，mNGS在病毒及少见病原体的检测中体现出较好的检测效能；但在细菌、真菌等病原体的检测中，mNGS尚不能准确判断菌群定植或感染状态，仍需依赖临床医师结合患者病情进行进一步分析。
⑤mNGS检测能力也不是无所不能，胞内感染菌(结核杆菌、军团菌、布鲁菌等)因释放到体液中含量较少而导致检测敏感性偏低。另外，具有较厚细胞壁的病原体(如真菌)，其核酸提取效率较低，导致检出率和敏感性较低。
⑥mNGS对胞内菌和厚壁微生物检出率低，因此即使在检测报告中某种/某些胞内菌/厚壁菌检出序列数不高，也要考虑其为致病病原体的可能。
⑦mNGS检测报告中提示某种/某些微生物检出序列数较高、基因组覆盖度高，表示检测到该病原微生物；在排除背景菌、污染菌和定植菌的情况下，可以考虑该微生物是致病病原体。
⑧RNA转录本身有更高的丰度和复杂度，又容易降解，对运输和保存的要求较高，因此mNGS对RNA 病毒的临床检测还存在一定的困难。常见的RNA病毒有艾滋病病毒、丙型肝炎病毒、乙型脑炎病毒、流感病毒、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、登革热病毒、轮状病毒、SARS病毒、埃博拉病毒、新型冠状病毒等。当临床上是这类病毒感染时，mNGS的作用很可能起不到意想作用。
⑨对于mNGS结果为阴性，但根据其他辅助检查结果(如培养结果)高度提示感染可能的尚不能排除感染的患者，建议必要时再次取样重复mNGS检测。
⑩mNGS信息量大，不可能在报告中列举出所有检测到的病原体，对于罕见病原体、胞内菌等，可能因检出序列数少、微生物丰度低，在报告中未能列举，如果临床有疑似特殊病原体的感染，可以追溯原始数据库进行查询。
⑪当前的mNGS尚不能完全指导耐药菌抗感染药物的选择，得到微生物的信息需结合患者的临床特征、当地细菌耐药的流行病资料学、传统病原学培养药敏结果等资料协助指导抗菌药物的选择。
参考文献：
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