在此基础上进行第2次酶切，回收中间载体线性片段与带有粘性末端的干扰片段再次连接，得到含有正义和反义干扰片段的P1022中间载体。
其原理是XbaⅠ和BglⅡ，分别是SpeⅠ和BamHⅠ的同尾酶，相互连接后能够形成反义干扰片段，并且酶切位点消失，无法再次酶切。
两次连接成功后得到含有正、反义干扰片段的RNAi中间载体，将它和表达载体P3301进行BamHⅠ和SacⅠ双酶切，酶切后分别回收RNAi表达盒和表达载体的线性片段，使用T4连接酶连接，最终构建好Psy2基因的RNAi干扰表达载体。
Psy2基因和psy2基因的开放阅读框都为2454bp，有7个外显子，编码817个氨基酸，但是两者氨基酸序列差异明显。
除了55个氨基酸残基替换外，psy2因为碱基突变形成新的起始密码子ATG，使得起始氨基酸Met较Psy2提前1位，但在其编码氨基酸序列的428号位置，因3个碱基的缺失，而丢失了一个精氨酸（ARG）。
由此可以推测，抗、感基因编码氨基酸的差异，造成了玉米细菌性褐斑病的抗、感表型。
基因Psy2和psy2编码的蛋白质，都由817个氨基酸组成，分子量分别为91.4KDa和91.0KDa，理论等电点分别为6.17和6.13，分子式分别为C4091H6336N1068O1220S52和C4064H6297N1065O1212S47。
Psy2和psy2蛋白的丝氨酸含量最高，分别占10.0%和10.2%；色氨酸含量最低，分别占1.8%和1.7%。
