上篇文章写到关于细胞凋亡根据不同时期的特点，有很多种检测方法，而我司常用的是下文讲解的三种：Annexin V/PI双染法、TUNEL染色法和Hoechst染色法。关于具体这三种方法的原理、操作步骤、结果判断以及优缺点，我们接着往下看。
一、Annexin V/PI双染法
Annexin V/PI双染法是基于生物学功能检测细胞凋亡的方法，即检测细胞膜完整性，可以使用流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测设备进行检测，目前流式是最常用的细胞凋亡检测方法之一。
原理：
Annexin V可与磷脂酰丝氨酸（PS）特异性结合，因此，可以作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。但Annexin V无法区分坏死细胞（中晚期凋亡细胞）和早期凋亡细胞。而碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）是一种核酸染料，不能透过细胞膜，但由于凋亡中晚期细胞和死细胞的细胞膜通透性增加，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红；而早期凋亡细胞和活细胞的细胞膜仍然完整，PI无法进入。所以将Annexin V与PI联合使用，即可将处于不同凋亡时期的细胞区分开：活细胞（Annexin V-/PI-）、早期凋亡细胞（Annexin V /PI-）、晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被Annexin V和PI结合染色呈现双阳性（Annexin V /PI ）。
图1 Annexin V/PI检测原理。
实验流程：
（1）收集细胞：在进行完细胞凋亡刺激后，用预冷的PBS洗涤细胞2次，4℃离心5min，（贴壁细胞使用不含EDTA的胰酶消化）；
（2）重悬细胞：取1～5×105个重悬的细胞，离心弃掉PBS，加入Annexin V-FITC结合液轻轻重悬；
（3）染色：加入Annexin V-FITC和PI Staining Solution，轻轻混匀；
（4）孵育：避光、室温孵育10~15min，随后置于冰上；
（5）检测：①流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光（激发波长488nm，发射波长525nm），PI为红色荧光（激发波长535nm，发射波长为615nm）；②在荧光显微镜下用双色滤光片观察，Annexin V-FITC荧光信号呈绿色，PI荧光信号呈红色。
结果判断：
图2 不同处理条件下Annexin V/PI双染流式法检测的细胞凋亡情况（Ribeiro et al., 2019）。（A）正常组；（B）溶剂对照组；（C）试验处理组。
如图2所示，在二维散点图上，Annexin V是X轴，PI是Y轴，十字门将图片分为四个象限。其中根据Annexin V染色分为左右两部分，右侧（Q2/3）为Annexin V染色阳性；根据PI染色分为上下两部分，上方（Q1/2）为PI染色阳性。一般认为Annexin V单染的细胞是凋亡早期的细胞，PI单染的细胞是已经死亡的细胞，而双染是凋亡晚期的。
左上象限Q1：(Annexin V-FITC)-/PI ，此区域的细胞为坏死细胞。也可能有少数的晚期凋亡细胞在其中，甚至机械损伤的细胞也包含其中。
右上象限Q2：(Annexin V-FITC) /PI ，此区域的细胞为晚期凋亡细胞。
右下象限Q3：(Annexin V-FITC) /PI-，此区域的细胞为早期凋亡细胞。
左下象限Q4：(Annexin V-FITC)-/PI-，此区域的细胞为活细胞。
细胞凋亡率：Q2与Q3象限百分率的和。
优缺点：
优点：
1、简便、快速；
2、可准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。
缺点：
1、制备贴壁细胞样品时，容易因消化和吹打造成细胞额外损伤，从而夸大了实验结果，增加了数据变异度；
2、凋亡细胞的本底荧光或非特异染色的特性会增强，造成荧光飘移，导致定量不准。
二、TUNEL染色法
TUNEL的全称是Terminal Deoxynucleotidyl Transferase mediated dUTP Nick-End Labeling，中文名为末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记。TUNEL染色法是通过检测断裂DNA片段的着色情况来判断处于凋亡状态的细胞数量，实际上是基于分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡切片、冰冻切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。
原理：
细胞在发生凋亡时会激活一些DNA内切酶，这些内切酶可以使染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可通过荧光显微镜或者流式细胞仪对凋亡细胞进行检测。
图3 TUNEL检测示意图（Christophe et al., 2021）。
实验流程（以细胞样本为例）：
（1）准备细胞爬片：PBS洗涤2次细胞爬片（贴壁细胞爬片），每次5min；
（2）细胞固定：用4%多聚甲醛固定细胞30~60min；
（3）细胞通透：加入破膜液破膜（Triton X-100）2次，每次5min，PBS清洗3次，每次2min；
（4）加TUNEL检测液：加入TUNEL检测液，37°C湿盒避光孵育60min。将细胞爬片浸入PBS中，室温放置5min，重复洗涤3次；
（5）检测：用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。
优缺点：
优点：
1、灵敏、快速、背景干扰小；
2、可直接使用在组织切片上，观察细胞凋亡发生的位置；
3、适用范围广泛，包含各类贴壁细胞（一般可制备细胞爬片）、悬浮细胞（或细胞悬液）、组织切片以及单细胞。
缺点:
1、坏死细胞亦有DNA裂点形成，也可呈现TUNEL反应阳性，因而特异性较差；
2、TUNEL结合免疫组化（IHC）检测时，固定过程对检测的影响较大，切片的大小、薄厚会直接影响到固定效果，从而产生结果的差异。
三、Hoechst染色法
Hoechst和DAPI染色一样是基于形态学来对细胞核进行染色，通过观察细胞凋亡时细胞核形态发生的变化来判断细胞是否凋亡。常用的是Hoechst 33258和Hoechst 33342，前者渗透性不如后者好，多用于活细胞染色，而后者活细胞和死细胞均可。
Hoechst染液不仅可直接用于固定细胞或组织的细胞核染色，也可直接用于活细胞或组织的细胞核染色。此外，Hoechst也可与PI结合，对细胞进行双重染色，之后可通过荧光显微镜拍照或流式细胞仪检测，以区别凋亡、坏死及正常细胞。
原理：
Hoechst是一种膜通透性荧光染料，能与DNA双螺旋小沟结合，尤其是富含AT的区域，故正常细胞和中早期凋亡细胞均可被Hoechst着色。正常细胞核呈圆形，DNA分布均匀，染色呈均匀蓝色；凋亡细胞核形似月牙或碎裂，由于浓集染色后呈亮蓝色固缩状或团块状，或核呈分叶，碎片状，边集。
图4 Hoechst染料和DNA结合的模式图（Jonas et al., 2018）。
实验流程（以细胞样本为例）：
（1）细胞爬片准备：培养过夜的细胞爬片去上清，PBS洗3次，每次5min；
（2）细胞固定：细胞爬片加4%多聚甲醛室温固定15~20min；
（3）Hoechst染色：在细胞爬片滴加Hoechst染液，室温避光孵育5~10min后，吸去染色液，在PBS中浸洗3次，每次3min；
（4）检测：用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。
优缺点：
优点：
1、无需用DAB显色，它直接结合细胞的DNA，经过紫外光激发后发出蓝色荧光；
2、可进行活细胞染色；
3、操作简单、便捷。
缺点：
1、荧光染料存在淬灭的问题，建议染色后尽量当天完成检测，活细胞或组织染色后需立即观察；
2、Hoechst染液对人体有害，需注意适当防护；
3、Hoechst通过紫外光激发，因此不能用于大多数台式流式细胞仪。
结果判断：
（1）定性分析：观察细胞核形状。
正常细胞：胞核光滑，圆形或椭圆形，染色均一，淡蓝色，内有较深的蓝色颗粒；
凋亡细胞：胞核碎片化，染色增强荧光更为明亮，蓝色发白（因DNA浓缩致密而深染）；
坏死细胞：胞核边缘不清晰；
正在分裂细胞：DNA致密深染，DNA分列两排；
分裂旺盛或核仁较大的细胞：核仁位置无Hoechst染色，呈现黑色，核边缘清晰，形状规则。
（2）定量分析：对总细胞和凋亡细胞进行计数后，分析3次独立重复数据并绘图。
文献示例：
如图5所示，与对照组相比，PA组的细胞凋亡率明显升高。与模型组相比，PA和不同浓度AS-IV共同处理组凋亡细胞明显减少，细胞凋亡率显著降低。相应的定量分析显示，AS-IV可降低PA刺激下的HK-2细胞的凋亡。
图5 Hoechst 33258染色细胞凋亡结果（Qingqing Chen et al., 2018）。（A）BSA对照组；（B）PA模型组；（C、D、E）AS-IV 10、20、40 μmol/L组；（F）A-E的定量分析。
参考文献
Christopher L Moore, Alena V Savenka, Alexei G, et al. TUNEL Assay: A Powerful Tool for Kidney Injury Evaluation[J]. Int J Mol Sci, 2021,22(1), 412.
Jonas Bucevičius, Gražvydas Lukinavičius, Rūta Gerasimaitė. The Use of Hoechst Dyes for DNA Staining and Beyond[J]. Chemosensors, 2018,6(2).
Qingqing Chen,Yong Su,Yinghui Ju,et al. Astragalosides IV protected the renal tubular epithelial cells from free fatty acids-induced injury by reducing oxidative stress and apoptosis[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2018,108.
Ribeiro A R C, Maria Lúcia da Silva Cordeiro, Silva L M P, et al. Myrciaria tenella (DC.) O. Berg (Myrtaceae) Leaves as a Source of Antioxidant Compounds[J]. Antioxidants, 2019, 8(8).
