蒙娜丽莎“消失”的眉毛和眼部
微笑为何如此神秘？
近500年来，人们一直对《蒙娜丽莎》神秘的微笑莫衷一是。透过画中人物“神秘的微笑”，观者体验到一位文艺复兴时期女子丰富的表情和多样化的内心情感：既矜持，又温柔，既高贵，又平和……
达·芬奇坚持的艺术原则之一就是“利用绘画完美地再现自然”。他认为，画家的大脑应当像一面镜子，总是能够捕捉到物体反射出的色彩，并且全面摄取它面前各种物体的影像。
为了追求画中人物“真实”的表达效果，他反复修改和刻画这幅肖像。完成的蒙娜丽莎在目光柔和，面带微笑，展露出绘画作品前所未有的人性。
X射线呈现的画面显示，达·芬奇反复修改和刻画这幅肖像
带着神秘微笑的《蒙娜丽莎》，让达·芬奇的其他杰作也相形见绌。不同的观者在不同角度，感受到她的笑都不同：有时她笑得舒畅温柔，有时又显得严肃，有时略含哀伤，有时似乎又显露出讥讽和揶揄。——画外观者，似乎与她产生共鸣，但又永远读不懂。达·芬奇留给观者想象的空间和余地。
为了达到画面的效果，借助“色彩透视”和“空气透视”，近景因为线性透视的关系显得更加清晰，而远处地平线则因大气层变得模糊。加强背景空间的远近关系，让主体人物清晰，背景虚化，增加了作品的空间感。
画面两边不对称的背景，让作品产生一种动态的视觉虚幻感，
被认为是产生神秘微笑的原因之一
如果仔细观看画面背景，就会发现两侧的背景并不对称，左边的地平线比右边的地平线要低，这样的背景或许也是让画作呈现出梦幻般效果的原因之一。
微笑或许只是一种“假象”
一个包括辛辛那提大学（ University of Cincinnati）神经学家在内的研究小组表示，蒙娜丽莎的微笑因不对称而不真实。他们认为，蒙娜丽莎的微笑只是一种“假象”。
在人物面部的处理上，达芬奇使用“晕染法”（又称“渐隐法”），模糊虚化处理人物轮廓线，模糊不清的轮廓和柔和的色彩让人物头像的一部分融入到另一部分，使得人物体积向画面深处延伸的空间效果。
