《最后的晚餐》的构图采用了一种被称为“三分法”的布局方法，“三分法”指的是把画布分割成九个相等部分的方法，这在许多古老的西方绘画中有广泛应用。
在这幅画中，达·芬奇利用了这条规则，将画面划分为上下的三份和横向的三份，形成了九块区域。这样的布局不仅让画面更显均衡美观，也能使人物比例更加协调，达到了美观和实用性的双重目的。
画面中的长桌被巧妙地设置成一个倒置的金字塔形，既突出了中间主角基督的地位，又给整个场景带来视觉上的向心力，这种三角形结构既富有动感，又给人一种稳定感，同时也增强了画面人物之间的联系。
除此之外，画面中还有大量关于“三个”的元素。例如，主桌上共有十二个人，象征着基督教的传统十诫加上两位福音传道者，窗户外有三位神秘的人物观看着室内的场景，背景墙上有三个开叉的大火炬等等。
