细胞膜为各酶创追相对稳定胞内环境的同时也造成了传质阻碍。跨膜运输受限导致酶在全细胞体内催化时的效率比体外催化慢1-2个数量级长链脂肪酸和碳氢化合物等疏水性底物的跨膜运输通常是困难的,因为它们在水性介质中的溶解性和分散性差，并且细胞膜的渗透性低。大肠杆菌外膜的外层主要由脂多糖组成，被认为是大型疏水底物转运到胞内的主要屏障。
许多物理化学方法可以改变细胞膜渗透性促进疏水分子的运输效率，从而提高全细胞反应效率。例如，可以通过添加表面活性剂、有机溶剂和共辄低聚物等化学试剂破坏细胞膜的完整性:利用超、电渗透、高温或冻融等物理方法处理也可提高细胞膜对疏水底物的渗透性。然而，这些方法对细胞膜完整性的破坏可能会对全细胞催化剂的细胞活力和代谢活性产生负面影响。
更好的解决方案是表达特定的膜转运蛋白以促进底物的摄入。外膜蛋白AIkL的表达显著增加了大肠杆菌细胞对烷烃和线性脂肪酸脂的摄取，并促进了整体级联转化。在大肠杆菌中过表达脂肪酸转运蛋白FadL，也有利于脂肪酸的全细胞生物转化。在细胞膜中引入转运蛋白的关键点之一是优化其表达水平，因为转运蛋白的过高表达可能会对细胞中级联酶的平衡表达产生负面影响，并可能导致有毒底物摄入过多而产生不良副作用。
烟毓胺辅因子NAD(P)H常常参与级联反应中反应物的还原和氧化。在全细胞生物转化过程中再生烟疏胺辅因子的方法之一是使用细胞内源葡萄糖代谢途径。理论上，从一个葡萄糖分子完全氧化成CO2过程中可以实现10到11个NAD(P)H分子的再生。转(例如大菌的PntAB和UdhA)可以使NAD(P)H在细胞中相互转化。此外，异源葡萄糖脱(GDH)37或甲酸脱酶(FDH)也可用于再生NADPH和NADH。另一方面，NAD(P)的再生可以通过NAD(P)H氧化酶以02作为电子受体实现。
酶级联中辅因子再生的另一种方法是利用合适的辅因子回收系统来构建氧化还原中性的多醇网络。一个很好的例子是将NAD依赖性醇脱氢酶和-TA与NADH依赖性AlaDH偶联，用于以醇为底物生产股，其中AlaDH用于同时实现NAD(H)辅因子和胺供体的循环。
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