pcr过程中的引物是什么,pcr过程中引物的作用是什么

首页 > 经验 > 作者:YD1662024-03-05 11:47:30

简介

PCR反应的目的是扩増特异的DNA片段,同时不产生非特异的副产物.一般来说,每一个物理和化学的因子都可以改变,以増加PCR产物,提高特异性和敏感性。然而,在众多参数中要获得理想的结果,引物设计是至关重要的。即使其他所有参数都是最优的,引物设计不好可引起非特异的扩增和或引物二聚体形成,导致PCR产物较少或根本没有产物,接下来主要介绍PCR引物设计的一般规律。

pcr过程中的引物是什么,pcr过程中引物的作用是什么(1)

引物长度

引物长度对反应特异性、解链温度、退火时间都有较大的影响,最终影响到PCR反应是否成功。多数情况下,引物长度约18~30bp,引物太短会导致非特异扩增,太长虽然会增加特异性,但是二级结构(如发夹结构)出现的概率增大。

引物的解链温度

PCR反应的特异性更大程度上依赖于引物的解链温度(Tm值),多数PCR反应最优的解链温度应在55~60℃,如果没有其他不稳定因素,引物的Tm值取决于它的长度、序列组成和浓度,离子强度的影响可以忽略不计,因为不同的PCR反应盐浓度变化不大。一个反应中所有引物的解链温度应尽可能接近。对于多数PCR反应而言,引物之间的Tm差应小于2~3℃。差值增大,反应效率会降低,甚至直接导致反应失败。因为T.值高的引物在低于退火温度的条件下错配,而Tm值低的引物在高于退火温度的条件下与模板只有低浓度结合。

一般来说,退火温度比引物解链温度低5'C,但是,根据这一原则得出的退火温度常常并不是最优的,必须通过实验获得最优温度,利用梯度热循环仪根容易实现这一目的。

复制子的解链温度

除了计算引物的解链温度以外,还要保证产物的解链温度要足够低,以保证其在92℃时完全解链,一般来说,100~600bp的片段可以有效扩增,该参数有助于使PCR效率更高,但并不总是成功的PCR所必需的。

二级结构

设计引物时,另一个需要考虑的重要因素是二级结构的存在。一个带有自身同源序列的引物可以回折形成部分双链的发夹结构,类似地,引物之间的同源可能引起引物二聚体的形成,.PCR反应时,相对于模板而言,引物浓度高很多,引物之间相互退火要比引物与模板之间退火容易得多。因此,引物如果存在3'发夹结构或者3'二聚体,这对于PCR扩増往往是致命的,因为这样会导致非特异的大量背景产物的扩增.避免出现二级结构的最简单的方法是选择GC含量约50%、四种碱基中缺少一种的引物。

重复

同一碱基或几个核苷酸的重复也应尽量避免,不同的重复对PCR反应的影响不同。若简单重复,或引起引物二级结合位点,导致非特异扩增。若反向重复,或引起结合区内形成发夹结构,导致PCR效率不高。

GC夹

在引物的3'端包含一个G或C残基可增加引物扩增效率,这就是所谓的GC夹。

它可以促进引物的3'端正确地结合到模板,因为GC夹可以形成更为稳定的氢键。

非目标同源

利用BLAST程序对引物序列进行查找目标DNA其他区域内是否有非目标同源,若有,则会产生非特异片段,降低特异性。

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