海巴戟(诺丽)果汁对抑制人血管生成和
破坏新生血管网络的作用
美国路易斯安那州立大学健康科学中心
美国路易斯安那州健康科学巾心
美国退伍军人管理局医疗中心
美国史丹利斯科特癌症中心
美国卓越神经科学中心
摘要:诺丽果汁,即由海巴戟植物的果实榨取的果汁,被用作药物已有数个世纪的历史。我们以人的胎盘血管和人类乳腺肿瘤作为血管生长的外植体来源,运用三维纤维蛋白凝块矩阵模型对诺丽果汁的效果进行了测试。相比于以生理盐水作为对照试验组,5%(体积分数)或更浓的诺丽果汁对胎盘血管外植体上新血管芽生长的抑制作用效果更为明显。该浓度的诺丽果汁对降低新毛细血管芽的生长速率和增殖速率效果也很显著。当在血管生长环境下使用浓度10%的诺丽果汁,几天内即可诱导肿瘤血管与毛细血管网终退化及凋亡。本研究也发现含10%诺丽果汁是人类乳腺肿瘤外植体的血管生长的良好抑制剂。在有血管生长的肿瘤外植体中,10%的诺丽果汁能在2到3天内促使肿瘤血管迅速退化及凋亡。
1 引言
血管生长的定义首先由福克曼在1971年提出,进一步发展了之前关于血管网络生长的理论。在普通成年人体内,血管生长常常与病理过程挂钩,除复发性增长与排卵期子宫内膜脱落外。在多样的病理条件下,如视网膜病变、类风湿性关节炎、牛皮癣、伤口愈合、肿瘤生长,原本静态的血管内皮细胞会随之转化为血管生长的表现状态。曾有人认为,启动此血管生成“开关”的分子机制是打破了血管内皮生长因子和抑制因子自然的动态平衡状态。启动血管内皮细胞生长的“开关”,然后细胞外基质被水解降解,细胞随之迁移和增殖,进而形成毛细血管结构和彼此交联的血管网络,任何这些连续步骤的中断或不通畅都有可能阻止或改善以上病症的出现。为此,目前相关机构正在审查许多能够作为抗血管生成剂的化合物的功效。另外一种思路由此出现,即阻止血管生长对于新生成实体肿瘤的形成具有重要的抑制作用。这一方法的目标是为了使传递给肿瘤细胞的营养中止,导致胂瘤细胞由于营养缺失而发生凋亡。目前已有关于大量化合物,包括长春花生物碱,秋水仙素,长春花碱,黄酬醋酸( FAA)在中断肿瘤血管牛长的功效的研究报道,但是它们发挥功效需要较高的浓度,且常常导致病人产生严重的副作用。康普瑞汀A4磷酸盐可以破坏肿瘤血管,同时保留周围正常的血管组织,尽管周围血管区域的肿瘤仍然持续生长,但这一现象意味着此药剂作为佐剂可在常规疗法使用。理想情况下,作用于血管系统的抗癌药物会抑制新的血管生长,从而阻断肿瘤的扩展和转移,同时还可攻击原发肿瘤本身的血管。
海巴戟植株及其果实在南大西洋的岛屿上作为药用食物已有很长历史。萨摩亚,大溪地和夏威夷的人们利用海巴戟果汁(诺丽果汁)治疗糖尿病,心脏病,高血压,肾病和膀胱疾病,而其果肉,树叶和树皮常常作为膏药治疗疮口,外伤和脓疮。近期研究表明,对植入Lewis肺癌细胞的小鼠用诺丽果汁每日进行腹腔注射,能明显提高小鼠寿命,这一发现说明其对小鼠免疫系统具有刺激作用。其他研究成果表明海巴戟根的氯仿提取物,即一种名为虎刺醛的蒽醌化合物能诱导ras转化细胞表型的正常化。该研究报道了海巴戟果汁的杭血管生长效果的相关数据。
2 材料与方法
2.1 海巴戟
海巴戟(诺丽)为市售商业化产品。pH值调至7.4,以130 Kgav的转速离心18h以去除残留的细胞碎片,并用0. 2μm的Nelgene过滤器进行过滤灭菌处理。
2.2血管生长模型
根据路易斯安那州立大学健康科学中心(LSUHSC)内审委员会(IRB)的认可协议,胎盘静脉血管从匿名志愿者的废弃胎盘中取得。将取出的静脉血管纵向切开,以使较厚的静脉组织以平面薄膜的形式充分展现。并利用无菌表皮切割器制造了若干直径2mm的静脉盘。这砦静脉盘之后被放人标准96孔培养板中(康宁公司,纽约康宁),培养板内已预置入凝血酶溶液(0.05IU,2μl/孔),并在使用前蒸发干燥。静脉盘在3小时内完成预处理过程,以确保内皮细胞的活性。来自不同志愿者的静脉盘在各治疗组之间随机分布,以减少抽样误差。
之后,将静脉盘覆盖以100μl血栓介质(HP-VAM),该介质中含有纤维蛋白原(3毫克/毫升)(Sigma公司,圣路易斯,密苏里州)和E-己酸(0.5%) (Sigma公司,圣路易斯,密苏里州)。HPVAM由介质199(美国英杰生命技术公司,马里兰州盖瑟斯堡),抗生素/抗真菌溶液(100荜位青霉素,100单位硫酸链霉素和0.25μgβ/mL两性霉素)(美国英杰生命技术公司,马里兰州盖瑟斯堡)和内皮细胞生长培养基(25%)(美国英杰生命技术公司,马里兰州盖瑟斯堡)制成。将上述物质混合制成凝块,在6%二氧化碳,94%空气,37℃条件的可增湿孵化机中进行培养。介质成形后,对含静脉盘的凝块补充100μl含20%胎牛血清的HP-VAM,单个板孔液体体积为200μl。
2.3血管生长情况的评估
利用20倍或40倍显微镜,以标准化计量网格为参考,进行显微观察测量,利用此方法可对所有板孔的血管生长萌芽情况每隔一天进行一次评估。血管生长以两个标准进行评估。第一,新血管生长比率,以从静脉盘外周生长的大约长度0.5mm的至少三个血管生长芽的形成为增生界定。基于可视化评分系统的血管生长指数(AI)是第二个用于在本研究中量化札管生长的参数。每个静脉盘分为四个象限,并从0到4对血管生长情况评分。将所有4个象限上的分数累加,并且血管生长指数将以一个范围为0到16的分数进行描述。这一方法使我们能够客观地评价实验中的各个孔板中血管生长的程度。平均血管生长指数在观察者组(n=4)之间与治疗组之间的相关性很妤(90%或更高)。通过图像分析评估发现血管平均长度与血管平均生长指数具有较高的相关度。
2.4 血管网的退化
经过7天在HPVAM中的生长,120个血管外植体随机分为测试组与对照组(每组各60个孔板)。60个孔板用含10%的诺丽果汁处理,另60个对照组孔板则用含10%的0.15摩尔氯化钠溶液处理。所有孔板都补充了新介质(包含10%诺丽果汁或10%氯化钠)并每隔两天评估一次血管生长的情况。在实验结束时,诺丽处理组和对照组的活性也将进行以网唑翁盐为基础的检测(MTT法测定活性套件,普洛麦格公司,麦迪逊,威斯康星)。
2.5细胞凋亡
我们利用S7100 ApopTag过氧化物检测试剂盒(Intergen公司,帕切斯,纽约)对10个海巴戟处理组和10个对照组血管外植体进行程序性细胞死亡,即细胞凋亡的检测。这一试剂盒的工作原理是基于检测DNA片段的末端标记法(TUNEL),利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)将单链或者双链DN游离的3'-OH末端进行酶标记。我们可以发现,在细胞核破碎和细胞发生凋亡时,3'-OH端被标记的DNA数量明显增加。然后可以用抗地高辛过氧化物酶检测地高辛标记的DNA。简而言之,组织外植俸以10%福尔马林处理,并固定于石蜡中制成石蜡切片,之后用去除石蜡的切片用蛋白酶K(20μg/mL.Oncor公司)处理15分钟。内源性过氧化氢酶用含2%过氧化氢的PBS溶液处理15分钟,然后漂洗切片,再用平衡缓冲液处理15秒,清除过量的平衡液,并立即加入末端脱氧核苷酸转移酶,将载玻片置于37℃温箱中进行孵育。停止加入洗涤缓冲液,再另外孵育10分钟,并将切片在PBS中洗涤3次,再用两滴抗地高辛过氧化物酶温育30分钟。载玻片用PBS洗涤3次,切片用DAB处理4-6分钟。之后载玻片用苏木精复染,在二甲苯中脱水,并进行显微观察。
