背景简介
在“单倍体诱导技术（一）”中，我们了解到通过单倍体诱导进行的单倍体加倍育种技术（Doubled haploid breeding）是近年来兴起的一种革命性纯系育种方法，只需要两代即可得到纯合的DH系，而传统的自交方法需要6-8代才能产生纯系，因此，单倍体加倍育种技术可以大大缩短育种进程。
目前，单倍体的获得方法有组织培养、CENH3介导的单倍体诱导、单倍体诱导系诱导等，在“单倍体诱导技术（一）”中，我们重点介绍了单倍体诱导相关基因MTL/ZmPLA1/NLD以及DMP的研究。在本文中我们将重点介绍单倍体诱导的另一个方法，即CENH3介导的单倍体诱导。
CENH3（着丝粒组蛋白3）是核小体组蛋白H3的变异体，仅存在于真核生物的功能着丝粒中，其主要参与着丝粒复合蛋白的募集和稳定，是细胞分裂时染色体分离所必需的，对着丝粒在染色体上的定位起重要作用(Sullivan et al., 2001)。类似于其他组蛋白，CENH3由两个结构域组成，一个N端尾巴（从核小体伸出，是翻译后表观修饰的靶点）和一个C端组蛋白折叠结构域（c-terminal histone fold domain, HFD）(Britt and Kuppu, 2016)。CENH3在植物中广泛存在，并且其功能在各个物种中保守。
序列替换或点突变的CENH3可补偿cenh3的突变，形成单倍体诱导系，同野生型植物杂交诱导单倍体的产生。近年来，CENH3介导的单倍体诱导方法在拟南芥、玉米、小麦上均取得了重要进展，接下来就和伯小远一起来看看相关的研究成果吧！
拟南芥
研究进展一
2010年3月25日，Ravi和Chan在Nature杂志上发表了题为“Haploid plants produced by centromere-mediated genome elimination”的研究论文，该研究发现CENH3的突变会导致合子发育过程中亲本染色体消除而产生单倍体，即利用修饰过的CENH3突变体材料cenh3与野生型材料进行杂交，在杂交后代中，来自突变体的染色体在融合后会被清除掉，从而形成了只有野生型材料染色体的单倍体材料。
该研究中主要采用两种途径修饰CENH3（图1），一种是在CENH3的N端融合绿色荧光蛋白（GFP-CENH3），另一种是用At1g13370编码的组蛋白H3.3的N端代替CENH3的N端，并融合GFP（GFP-tailswap）。将两种经修饰的CENH3分别转入拟南芥cenh3-1胚致死突变体，均可恢复植株的野生表型。GFP-tailswap植株仅能产生少量花粉，将其作为母本，与不同生态型拟南芥杂交，存活后代中能产生25%~45%仅含野生型染色体的单倍体，其余为二倍体和非整倍体。GFP-CENH3植株与野生型杂交，也能够诱导单倍体的产生，但其频率低于GFP-tailswap。
GFP-CENH3或GFP-tailswap植株自交后代没有出现单倍体。野生型作为母本与GFP-tailswap杂交，后代也可出现单倍体，但比例极低（表1）。这些拟南芥单倍体材料可以通过非减数分裂，形成加倍后的双单倍体材料，并且能够永久保持（图2）。
图1 利用修饰过的CENH3突变体材料与野生型杂交产生单倍体拟南芥(Ravi and Chan, 2010 )。（a）本研究中使用的GFP-CENH3和GFP-tailswap。（b-c）染色体分别在二倍体和单倍体拟南芥中的有丝分裂末期移动。（d-e）染色体分别在二倍体和单倍体拟南芥中的双线期移动。（f）单倍体（右）比二倍体具有更窄的莲座叶。（g）单倍体（右）的花比二倍体小。
表1 单倍体植株仅包含其野生型亲本的核基因组(Ravi and Chan, 2010)。
图2 单倍体拟南芥产生自然的二倍体后代(Ravi and Chan, 2010)。（a-l）二倍体（a-d）和单倍体（e-l）拟南芥中的减数分裂。（m）单倍体拟南芥植株体细胞中染色体的自发加倍，在单倍体植株上产生可育的二倍体分枝。
研究进展二
2015年9月9日，Britt教授团队在PLoS Genetics上发表了题为“Point Mutations in Centromeric Histone Induce Post-zygotic Incompatibility and Uniparental Inheritance”的研究论文，该研究发现点突变造成的HFD单个氨基酸改变会降低CENH3的着丝粒结合功能，这导致一些后代中的单亲遗传，促进了单倍体的产生。
该研究首先选择了六个突变等位基因（表2），并测试了它们互补cenh3-1突变体后，与野生型拟南芥杂交产生单倍体的能力。CENH3点突变体（tg cenh3*）被转化到CENH3/cenh3-1植物中，并对它们的后代进行了转基因和天然CENH3基因型的筛选（图3）。转基因实验结果表明，CENH3组蛋白折叠结构域保守残基中的各种突变并不会使单倍体诱导系的外观不正常，并且自花授粉时完全可育，在异系杂交时可诱导单倍体。因此，该研究猜测单倍体诱导系可能存在于诱变群体中，为了验证这一假设，作者分析了先前报道过的TILLING（targeting induced local lesions in genomes）群体，该EMS（Ethly methane sulfonate）处理的群体的突变密度为每兆碱基每株植物约3.89个突变。最终结果表明，利用EMS诱变和TILLING技术鉴定到了多个保守氨基酸位点（如P82S，G83E，A132T，A136T，A86V），其任一氨基酸的改变互补cenh3-1突变体后，与野生型拟南芥杂交可诱导单倍体的产生。
表2 本研究中使用的转基因和TILLING系的单倍体诱导率(Kuppu et al., 2015)。
