图9 玉米中基于CENH3介导的单倍体诱导结果(Kelliher et al., 2016)。
研究进展二
2021年1月20日，R. Kelly Dawe教授团队在Science Advances杂志上发表了题为“Haploid induction by a maize cenh3 null mutant”的研究论文，该团队利用cenh3无效突变的杂合子进行杂交获得玉米单倍体，极大简化了玉米单倍体的获得方法。
该研究首先通过CRISPR/Cas9技术获得了cenh3无效突变体，其突变类型为移码突变并在突变位点之后产生了一个终止子，进而去除了CENH3上的一大片功能区域（图10）。杂合突变体自交后，其后代没有任何纯合植株，这表明该突变纯合致死。当 /cenh3杂合突变体分别作为父本或母本，与野生型进行杂交后，通过染色体计数和流式细胞仪分析（图11）发现，当 /cenh3作为父本时，单倍体诱导效率为0.5%，而当 /cenh3作为母本时，单倍体诱导效率为5%。此外，该研究使用的诱导系是杂合子，与以往不同该诱导系的植株十分茁壮，并且可以与任何株系杂交一代之后即可得到稳定的单倍体植株（图12）。
图10 通过CRISPR/Cas9产生玉米cenh3无效突变体(Wang et al., 2021)。（A）Ubi-Cas9包括一个由玉米多聚泛素启动子驱动的密码子优化的Cas9；gRNA-ImmuneCENH3包括靶向CENH3第四个外显子的gRNA以及由2.2kb CENH3天然启动子驱动的不可切割的ImmuneCENH3基因；TailswapCENH3是基于ImmuneCENH3，但包括修改后的N端尾部和GFP标签。（B）玉米CENH3基因显示了用于基因编辑的序列。（C）野生型和突变体CENH3的预测蛋白序列，终止密码子出现在αN螺旋的第三个位置，这种截短的蛋白质可能与核小体外表面的DNA相互作用，但缺乏介导与核小体核心颗粒内其他组蛋白相互作用的序列。
图11 单倍体植株的确认(Wang et al., 2021)。（A）流式细胞仪检测是否为单倍体。（B）染色体传播，玉米二倍体有20条染色体，而单倍体有10条。（C）单倍体植物株型矮小。（D）单倍体植株不育，没有花药。
图12 基于GFP-tailswap的方法与cenh3无效突变体方法的比较(Wang et al., 2021)。（A）GFP-tailswap方法及其改进形式：在大多数应用中，表达结构改变的CENH3或其他突变形式的转基因用于补充功能丧失突变。EMS诱导的天然CENH3点突变也会被使用。在所有情况下，植物生长到成熟时都必须带有部分功能失调的CENH3基因，这会影响植株的性能。（B）cenh3无效突变体方法：单倍体诱导发生在配子体水平，图中显示了雌性配子体，其中三个有丝分裂细胞分裂将卵细胞中的CENH3稀释到低水平。
小麦
杂交小麦被认为是今后全球小麦产量大幅提升的首选途径之一。但是，由于小麦受基因组复杂性（异源六倍体）所限，小麦杂交育种一直停滞不前。同时，制种成本过高也大大制约着杂交小麦产业化推广。
2020年11月9日，吕建团队和Timothy Kelliher团队在Nature Biotechnology杂志上发表了题为“Generation of paternal haploids in wheat by genome editing of the centromeric histone CENH3”的研究论文。该研究通过筛选基因组编辑的TaCENH3α-杂等位基因组合，研究人员报道了小麦中可商业操作的父本单倍体诱导系（HI），其单倍体诱导率（HIR）为7%。
该研究首先在小麦中鉴定了CENH3的同源基因TaCenH3α和TaCenH3β，进一步检测发现TaCenH3α在子房和花粉中的表达高于TaCenH3β（图13a）。因此，作者设计了两个单gRNAs位点靶向TaCenH3α的三个等位基因：gRNA1靶向外显子1中N末端结构域的起始，而gRNA2靶向内含子2/外显子3剪接位点（图13b）。通过基因编辑对TaCENH3α的三个等位基因进行突变，重点关注的T0植物具有基因型（ /r，-/r，-/-）：即具有一个野生型和一个RFS（restored frameshift）等位基因的杂合子（-A）；具有1个敲除突变和1个RFS等位基因的杂合子（-B）；以及纯合突变（-D）（图13c）。使上述T0植物繁育出各种T1代，然后让T1代自花授粉，并作为雌性与野生型品系03S0352-22回交，以检测HIR。
结果表明，G23基因型（ /r，-/-，-/-）通过自花授粉得到6.9%（9/131）的单倍体，异系杂交后父本HIR为7.0%（4/57），T2代G23的异系杂交父本HIR为8%。此外，G24基因型（r/r，-/-，-/-）植株在T1代和T2代的诱导效率分别为0.7%和1.8%。而T1植物G18（ / ，-/-，-/-）不诱导单倍体，说明位于CENH3α-A的RFS（r）等位基因可能触发HI（表4）。以上结果还证实了TaCENH3α-A的RFS等位基因的杂合（ /r）组合加上-B和-D两个拷贝的敲除突变导致高HIR。
