摘，要:益生菌具有促进动物生长、提高机体免疫能力等生理功能,常用作微生态饲料添加剂。菌体 SFU-9 是一株蜡状芽孢杆菌,该菌株在不利环境下能够以孢子形式存在,具有耐高温、耐酸碱和耐挤压等优点,较乳酸菌、酵母菌等益生菌更能保持活菌状态,适合饲料加丁业的需要。
该研究以菌株 SFU-9 进行实验,研究发酵温度、接种量、培养基初始pH值、溶解氧等因素对菌株生长的影响,确定出取佳培养条件为:培养基初始 pH值为6.0~6.5,接种量5%(相对摇瓶装液量),培养温度 30-32℃,装液量 28 ~33 mL /250mL 。
发酵液中的活菌数可达10的11次方cfu/mL。在此基础上,采用单因子和正交实验相结合的方法,确定出最佳发酵培养基组成为:玉米淀粉 2.0%,啤酒酵母 1.5%,NaH2PO4 0.2%,Na2HPO4 0.2%，玉米浆 2.0%。
以最佳培养基配方给菌体提供营养,在最佳培养条件下培养,可以使发酵液中的活菌数高达 10的12次方 cfu / mL。
由于抗生素等药物性饲料添加剂产生的药物残留、细菌耐药性等危害,人们将日光投向了无毒、无公害的微生态饲料添加剂的研究和开发。
我国农业部 1994 年公布的能够用于生产微生态制剂的菌种有:乳酸杆菌、芽孢杆菌、粪链球菌、酵母菌和双歧杆菌。
芽孢杆菌具有耐高温、耐酸碱和耐挤压等优点,适合饲料加工业的需要，能够保持较高的活菌数。
孢子进入肠道后,能够在肠道上部迅速复活而发挥生理生化作用,促进动物生长,提高机体免疫能力,该菌在饲料工业中的应用具有远大前景。
所以,本实验选用了生产效率高、生产周期短的高密度深层液体发酵法培养菌株 SFU-9,在摇床培养的条件下确定了适合蜡状芽孢杆菌 SFU-9 生长的最佳生长参数,在确定的最佳生长参数的基础上进行培养基优化的研究,使发酵液的活菌含量进一步提高达到 10的12次方 cfu / mL,为该菌的工业化生产提供了理论依据和技术支持。
1 材料与方法
1.1 菌种
SFU-9 菌株,本实验室提供。
1.2 培养基
1.2.1 斜面菌种培养基(W/V)(pH=7.0)
蔗糖 3.0%，蛋白胨0.5%，酵母膏 1.0%，NaH2PO4 0.2%,Na2HPO4 0.2%，琼脂 2.0%
1.2.2 液体菌种培养基(W/V)(pH=7.0)
蔗糖 3.0%、蛋白胨0.5%、酵母膏 1.0%,NaH2PO4 0.2%,Na2HPO4 0.2%；
1.2.3 摇瓶发酵培养基(W/V)(pH=7.0)
基本培养基:蔗糖 3.0%，蛋白胨0.5%，酵母膏 1.0%,NaH2PO4 0.2%,Na2HPO4 0.2%；
1.2.4 活菌计数培养基(w/V)(pH=7.0)
蔗糖 3.0%，蛋白胨0.5%，酵母膏 1.0% ,NaH2PO4 0.2%,Na2HPO4 0.2%，琼脂 2.0%
1.3 培养条件
斜面菌种培养:30℃,恒温培养箱培养 24h。
液体菌种培养：用Φ1mm 的接种环取3 环斜面菌种于液体培养基中,装液量30 mL /250 mL三角瓶，八层纱布封口,八层纱布封口,30~31℃,160r/min摇床培养16~18h,镜检菌体形态正常上无杂菌后备用。
摇床发酵：基本条件：装液量 30 mL /250 mL三角瓶，接种量 2%(瓶装液量),八层纱布封口30℃,160r/min 培养时间 16~18h。
活菌计数:30℃,恒温培养箱培养 24h。
1.4 分析方法
pH值的测定:pH S-25型 pH 测定仪。
生物量测定：血球计数法和平板涂布法活菌计数。
2 结果与讨论
2.1 菌株 SFU-9生长曲线
采用血球计数方法在发酵过程中每隔 3h 取一次样，直至 33h 时止。做出菌株的生长曲线如图 1所示。
从图 1 可以看出，当培养时间达到 15~18h 左右时,菌种生长基本处于稳定期。
在 20 ~25h 时,有芽孢形成并大量产生孢子。该实验以菌体为目的产物,又因孢子具有耐高温、耐挤压和耐酸碱等性能，能够长时期保持活力,故从图中可知,该菌株的种龄为 16~18h,发酵时间为 21~24h。
2.2 培养温度
温度的高低与发酵中的酶反应速率、氧在培养液中的溶解度和传递速率等密切相关,从而影响菌体生长和产物合成。
本实验是在基本培养条件下,将培养温度由 30℃改为分别在 20,25,30,35，40,45℃下培养,采用活菌计数的方法测定发酵液中的活菌含量。菌株 SFU-9 的生长与温度的关系如图2示
从图2可以看出,该菌株的最佳生长温度是30~32℃。
2.3 发酵液初始 pH值
在基本培养基的组成不变的前提下,将培养基的初始 pH 值由 7.0 分别调为 5.5,6.0,6.5,7.0，7.5,8.0,然后接种培养。采用活菌计数方法测定发酵液中的活菌含量。pH值对菌株 SFU-9 的影响如图 3示。
