from The crRNA Maturation Pathways of Class 1 and Class 2 CRISPR-Cas Systems
在1类系统中，CRISPR阵列被转录产生长长的pre-crRNA。Cas6家族酶识别重复结构或序列，并将RNA加工成中间或成熟的crRNA。在某些情况下（例如，I-A型和I-B型），Cas6充当二聚体来处理非结构化的前crRNA。
2类系统中的crRNA成熟度差异很大。在II型中，tracrRNA（红色）和pre-crRNA形成双链体，它们被Cas9结合和稳定。这使得宿主蛋白RNase III能够进行处理。中间crRNA通过未知的RNA酶进一步成熟。II-C型系统被描述为采用RNase-III非依赖性途径。
在这里，重复序列内的启动子序列能够进行内部转录和成熟crRNA的形成，形成结合Cas9的crRNA：tracrRNA双链体。在V-A型和VI型中，Cas12a和Cas13分别识别其重复序列的结构和序列，以便切割茎结构上游的pre-crRNA。在 V-A 型中，会发生额外的未表征处理事件。通过VI型Cas13处理产生成熟的crRNA。
条条大路通罗马，生物演化过程中并不会设计好一切，在演化力量和环境压力的共同作用下，总会走出不同的合适的路径生存下来。crRNA不同的成熟路径就是最好的例证，生命科学的美妙之处就在此。
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CRISPR的基因编辑方法
靶向目标序列：基因编辑的第一步也是最重要的一步就是在基因组上找到需要进行编辑的位置。基因组数据庞大复杂，例如人类的基因组DNA大小达到3GB。在庞大的基因组中定位到需要剪切的部位需要一个高效、精准的定位方法。
形成DNA断裂：定位到目标基因组位置以后，借助核酸内切酶在DNA双链上形成双 链DNA断裂，以此激发细胞本身的DNA修复机制。
修复断裂同时引入敲除或敲入：DNA双链断裂后，会激发细胞本身的DNA修复机 制。细胞的DNA损伤修复包含两种主要途径，一种是非同源性末端结合 （Non-homologous End Joining, NHEJ），即易错修复。NHEJ途径会在修复位点引 起随机插入或缺失，造成移码突变，使得基因不再表达，由此形成基因敲除。另一种是同源*介导的修复（Homology directed repair, HDR），即精准修复。HDR途径能借助外源引入的单链或双链DNA为模板介导基因替换或插入，这种方式可以将一段DNA序列精准地插入特定的基因组位点，由此完成基因敲入或替换。
从实验角度来看，NHEJ的发生是因为未提供DonorDNA作为供体来进行HDR过程。
DNA断裂的修复是生物自救的本能，非同源末端连接(Nonhomologous end-joining,NHEJ)和同源*(Homologousrecombination)两种修复DNA断裂的方式广泛存在于大多数生物体内，Donor DNA的提供是提高了同源*可能。
在Donor DNA中引入突变信息是一种对DNA断裂的修复的巧妙应用，再结合CRISPR打断技术就是绝佳的精准突变目标DNA位点的手段了。
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方便的sgRNA
single guide RNA
天然的rRNA和tracrRNA复合物介导的Cas9剪切
人工设计的sgRNA介导的Cas9剪切
sgRNA设计基于自然界中天然存在的crRNA和tracrRNA。核苷酸1-32是天然存在的crRNA。核苷酸37-100是天然存在的tracrRNA。Briner等人在两个片段之间添加了-GAAA-接头，使它们成为一个单一的RNA片段。
