sgRNA序列和二级结构
简化了CRISPR系统，这样就不必在实验中表达三种东西（即Cas9，tracrRNA和crRNA）。相反，只需要表达Cas9和sgRNA。部件越少，越可靠，系统效率越高。
sgRNA序列和二级结构以及设计思路
sgRNA二级结构，灰色矩形区域代表全长sgRNA支架中的额外的重复序列与其重复反义序列，在基因工程设计sgRNA时候通常是被去掉的。黄色区域代表sgRNA的3'尾巴，这对于Cas9功能不是必要的，在sgRNA-bound结构中是被省略掉的。
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CRISPR的失误“off-target”
失误在所难免，生命科学也在其中。
CRISPR切割目标DNA是依赖于sgRNA对靶序列的互补结合作用的。在当下优化后的工程化 CRISPR系统包含两个组件：一是Cas酶，特异性的切割其PAM位点上有的3和4碱基之间的，造成DNA链断裂。一是sgRNA，其一方面提供互补作用结合到目标靶序列，一方面提供特殊的一段序列和Cas酶结合，将Cas酶拉到目标序列旁边，使得Cas酶识别旁边的PAM位点后进行DNA切割。
实际生物基因组序列复杂度非常高，高度相似的序列往往存在，而在非完全匹配的情况下，CRISPR系统也是可以工作的。
因此在实际应用中脱靶效应是必须要考虑进去和考察的。
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CRISPR的技术扩展
张峰实验室对CRISPR系统做了一步小小的改造，才让Cas9系统有了其后的大放光彩。
这个问题说穿了会让人顿觉恍然大悟甚至觉得不值一提，Cas9系统无法使用在高等动物中的原因，仅仅是因为哺乳动物细胞具有细胞核和核膜，RNP（crRNA-cas9复合体）无法进入细胞核对DNA进行切割。张峰的做法是给cas9蛋白添加了SV40 NLS（Nuclear localization sequence），帮助Cas9进入细胞核。这样一来，哺乳动物细胞基因编辑的最后一个障碍也被克服了。
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CRISPR-PAM-Cas
CRISPR靶向特异性是由两部分决定的，一部分是RNA嵌合体和靶DNA之间的碱基配对，另一部分是Cas9蛋白和一个短DNA序列，这个短的DNA序列通常在靶DNA的3‘‘末端作用，被称为protospacer adjacent motif（PAM）。
PAM（CRISPR序列临近的3个核苷酸NGG为PAM）作为CRISPR序列在基因组上的一个标记，对于靶向识别至关重要，靶向识别的结果是Cas9的两个核酸内切酶结构域(两把”分子剪刀“)将PAM前的3-4核苷酸间的3'-5’磷酸二酯键切断，造成DSB（双链断裂）。
