CRISPR介导的细菌免疫机制（from金斯瑞）
CRISPR/Cas适应性免疫系统分为两个主要阶段：免疫获得和免疫效应。
在免疫获得阶段，Cas蛋白剪切外源性病毒DNA，然后将该外源性DNA作为间隔序列（Spacer）插入细菌基因组重复间隔区序列之间,插入位置为首个重复序列前。
在这个阶段Cas9是通过识别病毒DNA中的PAM（NGG）位点后进行切割，才有后续一系列反应的。
在免疫效应阶段，当细菌再次感染病毒后，重复间隔区序列转录形成前体crRNA（Pre-crRNA）。随后Cas核酸内切酶在反式激活crRNA（tracrRNA）指导下与前体crRNA结合，经RNAse III剪切后形成成熟的 crRNA-Cas-tracrRNA复合物 。成熟的crRNA作为gRNA（GuideRNA,gRNA）与病毒DNA配对，触发Cas剪切活性进而干扰病毒DNA正常复制的。
在这个阶段，Cas9在其结合gRNA的指引下结合到PAM前的序列，然后识别PAM后进行切割工作。换句话说，就是说gRNA将PAM放到Cas9面前。
from金斯瑞
Cas蛋白的PAM特异性是可改造的。
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CRISPR拓展应用
from金斯瑞
利用CRISPR/Cas能特异性的结合特定序列的性质，进行改造应用。
逆练武功的CRISPR介导的ChIP技术
染色质免疫沉淀技术（Chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是研究DNA 与蛋白质相互作用的主要方法。
传统的ChIP是靶定特定蛋白质，在活细胞状态下固定蛋 白-DNA复合物，将其随机切断为片段，然后通过免疫学方法特异性地富集目的蛋白结合 的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
CRISPR/Cas9介导的ChIP是反向的，即靶定基因组区域然后鉴定哪种蛋白质在那里。通过将细胞核定位信号和表位标签引入催化失活的Cas9 （dCas9），可形成通过gRNA 靶向的DNA结合蛋白。
现有gRNA数据库和设计工具能够靶向任何目的基因。而 dCas9与染色质形成的复合物可以用传统的染色质免疫沉淀 （ChIP） 技术进行纯化，并 通过质谱进一步鉴定。
CRISPR介导的CHIP技术已被用于识别与干扰素调节因子1 （IRF-1） 的启动子区 域相关的蛋白，其受到干扰素γ刺激会产生反应。在该研究中，研究人员纯化了15种相关蛋白，包括组蛋白脱乙酰基酶复合物以及转录因子、组蛋白和其他DNA相关蛋白。相比传统的CHIP方法，CRISPR介导的CHIP具有众多优势。
传统的ChIP的大规模分析需要使用靶向每种DNA结合蛋白的多个抗体或者生成并表达表位标记蛋白，但 CRISPR/Cas9系统的模块化特性只需靶向Cas9蛋白的单个抗体进行纯化。此外， CRISPR/Cas9系统不受基因表达水平低、差异基因表达或毒性基因表达等问题的影响。
巧妙改造的CRISPRi/CRISPRa
利用dCas9无核酸内切酶活性但仍能与DNA结合的特点设计的CRISPR/dCas9系 统，可按照预先设计的gRNA靶向特定基因的转录起始位点上游，同时结合转录激活或抑 制相关因子启动或终止靶向基因的转录来调控靶基因的表达。
博德研究所的张锋实验室率先将CRISPR/Cas9协同转录激活调节子 （SAM） 系统 应用于基因激活试验。SAM系统能够强效激活内源性基因的转录，其通过gRNA靶向结 合到转录起始位点上游200 bp内的位置。利用SAM系统激活基因表达方面的研究表 明，通过转录激活，可使部分基因的转录提高到原来的3000倍。同时SAM系统具有 多重基因激活能力，可同时激活10个基因的转录。此外研究还证明SAM可激活非编码元 件，如基因间区长链非编码RNA。使用靶向全基因组的SAM gRNA文库进行功能获得性筛选，可快速鉴定出疾病模型 或发育/分化过程中控制目的表型出现的关键基因42。博德研究所设计的靶向人全基因组 SAM文库针对每个基因设计3种不同的gRNA，每个gRNA靶向23430个编码亚型中的一 个，这些亚型包含人类基因组中独特的转录起始位点，该SAM文库总共包含70290条 gRNA。
其余的CRISPR活体成像也是基于对Cas蛋白的目的性改造完成的。
可以说CRISPR系统的发现和应用极大地促进了DNA/RNA和蛋白互作的操作水平。
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CRISPR/Cas系统的医疗应用
遗传性疾病的纠正CRISPR/Cas9最令人兴奋的应用之一是它可用于治疗由单基因突变引起的遗传性疾病。此类疾病的例子包括囊性纤维化 （CF）、杜氏肌营养不良症 （DMD） 和血红蛋白病。到目前为止，这种方法目前仅在临床前模型中得到验证，但有希望很快将其转化为临床实践。
Schwank等人使用CRISPR / Cas9来研究CF的治疗。使用从两名CF患者获得的成人肠道干细胞，他们成功地纠正了肠道类器官中引起CF的最常见突变。他们证明，一旦突变被纠正，CF跨膜导体受体（CFTR）的功能就会恢复。另一种已经研究CRISPR / Cas9的疾病是DMD。Tabebordbar等人最近使用腺相关病毒（AAV）递送CRISPR / Cas9核酸内切酶，通过删除含有原始突变的外显子来恢复DMD小鼠模型中的肌营养不良蛋白表达。这会产生截短但仍然起作用的蛋白质。治疗的小鼠被证明可以部分恢复肌肉功能缺陷。值得注意的是，在补充成熟肌肉组织的肌肉干细胞中编辑了肌营养不良蛋白基因。这对于确保CRISPR / Cas9的任何治疗效果不会随着时间的推移而消退非常重要。
两项类似的研究描述了在体内使用CRISPR / Cas9系统来增加肌营养不良蛋白基因的表达并改善DMD小鼠模型中的肌肉功能。其他研究使用CRISPR / Cas9在体外靶向人类肌营养不良蛋白基因中外显子的重复，并表明这种方法可以导致DMD个体的肌管中产生全长肌营养不良蛋白。
CRISPR / Cas9也可用于治疗血红蛋白病。Canver等人最近发现，CRISPR/Cas9破坏BCL11A增强子可以在小鼠和原代人红细胞中诱导胎儿血红蛋白。将来，这种方法可以使胎儿血红蛋白在成人血红蛋白异常的患者中表达。对于患有镰状细胞病或地中海贫血等疾病的患者，这将代表一种新的治疗策略。
艾滋病毒的治疗CRISPR/Cas9的另一个潜在临床应用是治疗传染病，如HIV。虽然抗逆转录病毒疗法为艾滋病毒提供了有效的治疗方法，但由于病毒永久整合到宿主基因组中，目前尚无治愈方法。
Hu等人表明，CRISPR / Cas9系统可用于靶向HIV-1基因组活性。这种灭活的HIV基因在各种细胞中的表达和复制，这些细胞可以潜伏感染HIV，而没有任何毒性作用。此外，细胞也可以针对HIV-1感染进行免疫。这是克服当前如何消除感染者艾滋病毒问题的潜在治疗进展。经过进一步的改进，作者认为他们的发现可能使基因疗法或基因改变的骨髓干细胞或诱导多能干细胞的移植能够根除HIV感染。贺先生就是因为相关应用进去的。
体外工程体细胞治疗恶性肿瘤或其他疾病人们对使用CRISPR / Cas9修饰患者来源的T细胞和干细胞/祖细胞的可能性越来越感兴趣，然后可以将其重新引入患者体内以治疗疾病。这种方法可以克服与如何有效地将基因编辑传递给正确细胞相关的一些问题。
T细胞基因组工程已经在治疗血液系统恶性肿瘤方面取得了成功，并有可能治疗实体癌，原发性免疫缺陷和自身免疫性疾病。T细胞的遗传操作以前效率低下。然而，舒曼等人最近报道了一种基于CRISPR/Cas9系统的人类CD4 T细胞更有效的方法。他们的技术允许对原代人类T细胞中的基因组进行实验和治疗性敲除和敲入编辑。他们证明T细胞可以以防止PD-1蛋白的表达，其他研究表明，这可能允许T细胞靶向实体癌。
人们也有兴趣在多能干细胞或原代体细胞中使用CRISPR / Cas9介导的基因组编辑来治疗疾病。例如Xie等人12表明，引起β地中海贫血的突变可以在人诱导的体外多能干细胞中得到纠正。他们认为，在未来，这种方法可以为骨髓移植提供细胞来源，以治疗地中海贫血和其他类似的单基因疾病β。
局限性在将CRISPR/Cas9的潜力转化为临床的有效治疗之前，仍然存在许多挑战。一个特殊的问题是如何将基因编辑传递给正确的细胞，特别是如果要在体内进行治疗。为了在体内安全地递送编码Cas9核酸酶基因并引导RNA而没有任何相关毒性，需要合适的载体。AAV以前一直是基因传递的首选选择。然而，这种递送系统可能太小，无法有效转导Cas9基因。可以使用较小的Cas9基因，但这对疗效有额外的影响。 许多其他非病毒递送系统正在研究中，这一过程需要进一步优化。
另一个重要的问题是，脱靶效应。基因组的错误编辑可能会给患者带来严重的长期并发症，包括恶性肿瘤。在限制脱靶活性时，Cas9核酸酶的浓度和Cas9表达的时间长度都很重要。尽管最近对核酸酶的修饰提高了特异性，但需要进一步的工作来最大限度地减少脱靶效应并确定任何治疗的长期安全性。
本文中考虑的CRISPR / Cas9的治疗应用主要针对体细胞。围绕CRISPR / Cas9的一个特别有争议的问题是胚胎中的基因编辑。已经表明，CRISPR / Cas9技术可以改变人类胚胎3的基因组，理论上可以证明可用于遗传疾病的植入前治疗。然而，种系的任何基因改造都是永久性的，长期后果尚不清楚。许多人在任何情况下都反对种系修饰，理由是最终后果可能是非治疗性遗传增强。
from金斯瑞
此外，可以使用CRISPR/Cas9的伦理界限仍有待完全确定，该技术有可能彻底改变许多儿科疾病的治疗，在临床实现这种潜力之前，必须克服许多实际和道德挑战。
和许多新兴科技一样，基因编辑也是一把双刃剑。慎重使用是负责的态度，不必恐慌，不必苛责。潜在的受益人是所有人的技术是值得的。
