分别准确称取5mg的2种代谢物标准品溶液（5-羟基松柏醛和5-羟基松柏醇）置于5mL容量瓶中，用100%色谱级甲醇脱气5min左右，待溶液完全溶解后。方可取出容量瓶放置在室温下降温至25℃左右，缓慢使用甲醇溶液对其进行定容。
然后对溶液过滤，并使用逐级稀释的方法配成一系列梯度浓度的混合溶液，每个梯度标准品溶液为1mg/mL。所述2种代谢物与色谱级甲醇关系为（0.5~2）mg:1mL，以便备用。
线性回归方程的构建根据不同物质质谱响应信号的差异，将5-羟基松柏醛/醇标准品，分别溶于5mL100%色谱级甲醇溶液中。
接着，将其分别稀释成0.1μg/mL、0.3μg/mL、0.5μg/mL、0.7μg/mL、0.9μg/mL的标准溶液，通过标准品溶液含量的检测，分别得到两种样品的标准曲线。
样品溶液的制备分别取15、39、47、55、63、79和102DAF（花后天数）的梨果实各15个，对其进行切割。分别称取2g的待测物与30mL质量浓度为90%的乙醇水溶液混合，然后在70℃下进行超声提取40min，6000r/min离心12min。
离心后缓慢取上清液部分并使用氮气进行吹干，再向其中缓慢加入2mL100%色谱级甲醇再一次溶解并过滤，所得的不同滤液作为样品溶液待用。
待测样品HPLC检测采用高效液相色谱法分别测定待测样品中5-羟基松柏醛、5-羟基松柏醇的吸光度。测定条件如下：所述梯度洗脱包括依次进行的四个梯度，具体为第一梯度洗脱、第二梯度洗脱、第三梯度洗脱和第四梯度洗脱。
