《最后的晚餐》是达·芬奇受米兰公爵的委托，画在一个修道院餐厅的泥灰墙上的。
整个画幅长880公分，宽460公分。
达·芬奇摒弃传统的湿壁画画法——颜料必须在石灰墙面“未干”时就被涂上以便它慢慢变干变硬——
首次大胆尝试把自己调制的蛋彩颜料直接画在干燥的墙面上。
但由于米兰空气潮湿，且达·芬奇的颜料涂得很薄，致使画面在半个多世纪之后就开始出现霉斑和剥落。
在今天，我们面对的只能是一个衍生的文本，一个不断被叠加、不断被修正或被重新“阐释”的文本，原始文本已经被“擦除”，只留下不断被涂写的“踪迹”。
依照面对画幅的观者位置来看，画面上13个人物的排列从左到右依次是：
巴多罗买、小雅各、安德烈、老彼得、犹大、约翰、耶稣、多马、老雅各、腓力、马太、达太、西门。
耶稣两旁的人物三个一组，其中每个人都在其小组内，并与邻组构成一个统一体。
约翰、犹大和彼得
紧挨耶稣右边的是约翰、犹大和彼得。
彼得坐得最远，听到耶稣的话后，他从犹大身后迅速站了起来，动作与他那暴烈的性格相吻合。
而此时，犹大内心恐惧，双眼向上看，他斜靠在桌子上，右手紧握钱袋，同时左手却做了一个不自觉的痉挛动作，仿佛在问：“这话是什么意思？会发生什么事呢？”
彼得一面用左手抓住向自己斜靠过的右肩，一面指向耶稣，向那位受主宠爱的门徒表示，要他询问谁是叛徒。
彼得右手握着一把小刀，他偶然地、无意识地用小刀捅犹大的肋部，犹大惊恐向前猛扑，打翻盐瓶——这是一个极具独创性的效果。
这组人物可以被看作是第一组，也是最完美的一组。
在耶稣的右边，温和的动作预示着即将来临的复仇，其左边的人物则流露出对背叛的恐惧和憎恶。
多马、老雅各、腓力
老雅各向后退缩，双臂以恐惧的动作展开，目光凝视，俯首向下，仿佛双眼目睹着他用耳所听到的令人震惊的事件。
倾向耶稣，他双手放在胸前，仿佛在表白：“主啊，不是我——你知道——你看得见我纯洁的心——绝不是我！”
