图六
4
分析引物并选择
选择一条引物，点击上方“Analyze”，然后点击“Key info”内的“Selected Primers”，会弹出两条引物的序列和其他概括信息如图七。这里需要确保|3`△G|≤9kcal/mol，以防止在错配位点形成双链结构引起DNA聚合反应。
图七
满足图七后，要继续进行6项分析以确保自己的引物是最合适的，这6项我在图八中已经标识，我接下来将结合自身经验逐一细讲。
图八
①二聚体形成分析：为了防止引物之间相互形成二聚体，我们需要点击“Duplex Formation”分析“Forward Primer”,“Reverse Primer”，确保△G≤4.5kcal/mol，hydrogen bonds≤3，如图九右。求稳的话还要分析“Upper Oligo”和“Lower Oligo”,那样可以阻止上下游引物之间形成二聚体。
图九
②发卡结构分析：为了阻止发卡结构形成，需要选择菜单内“Hairpin Formation”，分析“Forward Primer”,“Reverse Primer”，同①一样要确保△G≤4.5kcal/mol，hydrogen bonds≤3。
③碱基组成与Tm值：点击图八中的3的“Composition&Tim”分析，按规矩需要控制上下游引物GC含量在40%-60%，上下游引物GC含量也不可以差太大，但其实实际中，引物GC含量70%我也扩成功过，上下游引物GC含量差10%也可以做，所以请根据自己实际情况抉择，在Oli'go7里分析的结果给出的参数很多，你只要看我图十左里红圈的两个参数即可。
