沙门菌菌落图片,沙门菌快速检测方法

首页 > 经验 > 作者:YD1662024-03-05 17:21:46

沙门菌菌落图片,沙门菌快速检测方法(5)

(2)接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾培养基,也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于(36±1)℃培养18~24h,必要时可延长至48h,按表2-4判定结果。将已挑菌落的平板储存于2℃~5℃或室温至少保留24h,以备必要时复查。

沙门菌菌落图片,沙门菌快速检测方法(6)

反应序号A1:典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、氰化钾和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常,按表2-5可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。

反应序号A2:补做甘露醇和山梨醇试验,沙门氏菌靛基质阳性变体2项试验结果均为阳性,但需要结合血清学鉴定结果进行判定。

反应序号A3:补做β-半乳糖苷酶试验(ONPG)。ONPG阴性为沙门氏菌,同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。

必要时按表2-6进行沙门氏菌生化群的鉴别。

沙门菌菌落图片,沙门菌快速检测方法(7)

(3)如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统,可根据5.1.2(1)的初步判断结果,从营养琼脂平板上挑取可疑菌落,用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液,使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。

5.1.3 血清型鉴定

用营养琼脂平板上的单个菌落作为玻片凝集试验用的抗原。然后按照定型血清说明书依次进行O抗原、H抗原及Vi抗原的鉴定。

5.2 生化鉴定试剂盒方法

API20E试验条由20个含干燥底物的小管所组成。这些测定管用细菌悬浮液接种。培养一定时间后,通过代谢作用产生颜色的变化,或是加入试剂后变色而观察其结果。

按照生化鉴定试剂盒操作说明,将以上菌悬液加入20E反应条的各反应孔内,放入反应槽中,置37℃温箱中培养24h。取出后根据说明书观察反应结果,在软件上记录结果,系统将自动出现检测结果。所得反应的类型必须以数字化形式记录在报告单中,每3个测定为一组,每个以1、2和4标明,在每组中,阳性反应以相应的数字相加,由API20E的20个测定可得一个7位数,通过分析即可鉴定获得细菌类型。

5.3 分子生物学鉴定方法

用PCR进行鉴定,亦可根据5.1.2(1)的初步判断结果,从营养琼脂平板上挑取可疑菌落,用无菌去离子水制成菌悬液,水浴煮沸10min,3000r/min离心5min,以上清液为模板,进行扩增。上游引物为:5′-GTG AAA TTA TCG CCA CGT TCG GGC AA-3′,下游引物为:5′-TCA TCG CAC CGT CAA AGG AAC C-3′。反应体系:10×buffer5μL,TaqDNA聚合酶(2U/μL)1μL,氯化镁溶液(25mmol/L)5μL,dNTP(2.5mmol/L)5μL,ddH2O29μL,上游引物(10μmol/L)2μL,下游引物(10μmol/L)2μL,模板1μL。反应条件:95℃预变性5min,94℃变性30s,64℃退火30s,72℃延伸30s,30个循环,PCR产物用1.5%的琼脂糖在100V条件下进行电泳,得到扩增长度为284bp的扩增产物为沙门氏菌阳性。

5.4 VIDAS鉴定方法

用可疑菌落制成菌悬液或以下方法培养菌液以备检测:

(1)预增菌 无菌方法在225mL缓冲蛋白胨水中加入25g(25mL)待检样品,混合混匀后,35~37℃孵育16~20h。

(2)选择性增菌 孵育之后,转1mL悬液至10mLSC肉汤中(或1/10稀释)。35~37℃孵育6~8h。同时转0.1mL预增菌肉汤至氯化镁孔雀绿大豆(RVS)肉汤中,41~42℃孵育6~8h。

(3)后增菌 孵育之后,从SC肉汤中转1mL至M肉汤,从RVS肉汤中转1mL至另一份M肉汤。

孵育之后,混匀肉汤,从两份M肉汤中各取1mL加入一个试管封口并在95~100℃水浴中加热15min。冷却后进行VIDAS鉴定。

(4)将所需试剂取出,使其恢复至室温(至少30min)。

(5)每个样品使用一条SLM(沙门氏菌)试剂条及一个SLM固相容器,先必须做好质控和校正。确保取出试剂后,将装有剩余固相容器的袋子重新密封好。

(6)输入所需的信息以便建立工作类列表(work list),键入“SLM”至检测编号,再输入将要检测待检样品的试验号。标准(S1)必须在work list的首位并做双份,随后是质控(C1)和(C2)。

(7)吸取500μL的质控或样品至SLM试剂条样品孔。依屏幕所示,将固相容器和试剂条放入仪器的相应位置。核对位置以确保固相容器上3个字母编码的颜色标记与试剂条相符。

(8)根据操作手册进行检测。所有分析过程都由仪器自动完成。整个过程约需45min。

5.5 乳胶凝集试验方法

用沙门氏菌多价血清致敏乳胶制成的乳胶抗体,建立沙门氏菌乳胶凝集试验检测方法。直接将可疑单个菌落涂布于玻片上,然后滴加乳胶血清,观察其凝集情况。乳胶凝集试验操作简便、快速、敏感性高、特异性强且可用于现场检测,是一种适合基层单位用来检测沙门氏菌的可靠方法。

5.6 ELISA方法

(1)抗原的制备 待检样品在增菌液中增菌后,取1mL增菌液于离心管中,3000r/min离心10min,收集沉淀用PBS洗涤后,用少量PBS悬浮,于水浴锅中煮沸20min,冷却后于4℃保存备用。

(2)包被 在每个聚苯乙烯板的反应孔中加50μL制备的抗原,于50~60℃烘干,冷却后,加甲醇固定5~10min,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3min。

(3)加酶标抗体 于各反应孔中加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)50μL。37℃孵育2h,洗涤。

(4)加底物液显色 于各反应孔中加入临时配制的TMB(3,3,5,5-四甲基苯胺)底物溶液50μL,37℃孵育20min。

(5)终止反应 于各反应孔中加入2mol/L硫酸50μL。

(6)结果判定 可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“+”“-”号表示。也可测光密度(OD)值:在ELISA检测仪上,于450nm处,以空白对照孔调零后测各孔OD值。每次试验设阴、阳性和空白对照。

上一页12末页

栏目热文

文档排行

本站推荐

Copyright © 2018 - 2021 www.yd166.com., All Rights Reserved.