组分的MS和1H和13C（NMR）数据与已经报道的数据进行对比，确定从CCC中分离出来的化合物结构为槲皮素-3-O-洋槐糖苷(1)，芦丁（2），槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(3)，山奈酚-3-O-洋槐糖苷(4)，山奈酚-3-O-芸香糖苷(5)。如图2-9所示。
各组分物质的MS数据如表2-5所示。
各组分物质的1H和13C-NMR数据如下：
槲皮素-3-O-洋槐糖苷(1):1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:12.56(1H,brs,5-OH),7.65(1H,dd,J=8.4,2.0Hz,6′-H),7.51(1H,d,J=2.0Hz,2′-H),6.82(1H,d,J=8.4Hz,5′-H),6.39(1H,d,J=1.2Hz,8-H),6.19(1H,d,J=1.2Hz,6-H),5.32(1H,d,J=7.6Hz,1″-H),4.40(1H,brs,1‴-H),1.06(3H,d,J=6.4Hz,6‴-H).13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:177.6(C-4),164.4(C-7),161.5(C-5),156.7(C-9),156.6(C-2),148.7(C-4′),145.0(C-3′),133.7(C-3),122.2(C-6′),121.3(C-1′),116.2(C-5′),115.4(C-2′),104.1(C-10),98.9(C-6),93.8(C-8),102.2(C-1″),100.2(C-1‴),73.8(C-5″),73.3(C-3″),72.1(C-4‴),71.3(C-2″),70.9(C-3‴),70.7(C-2‴),68.5(C-4″),68.3(C-5‴),65.3(C-6″),18.2(C-6‴)。以上数据与文献报道一致，确定为槲皮素-3-O-洋槐糖苷。
芦丁(2):1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:12.57(1H,brs),7.54(1H,dd,J=8.0,2.0Hz,H-6′),7.53(1H,d,J=2.0Hz,H-2′),6.84(1H,d,J=8.0Hz,H-5′),6.39(1H,d,J=1.5Hz,H-8),6.20(1H,d,J=1.5Hz,H-6),5.33(1H,d,J=8.0Hz,H-1″),4.38(1H,brs,H-1‴),1.07(3H,d,J=6Hz,H-6‴).13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ：177.4(C-4),164.1(C-7),161.3(C-5),156.7(C-9),156.5(C-2),148.5(C-4′),144.8(C-3′),133.3(C-3),121.7(C-6′),121.2(C-1′),116.3(C-5′),115.3(C-2′),104.0(C-10),101.2(C-1″),100.8(C-1‴),98.7(C-6),93.7(C-8),76.5(C-3″),75.9(C-5″),74.1(C-2″),71.9(C-4‴),70.6(C-3‴),70.4(C-4″),70.0(C-2‴),68.3(C-5‴),67.1(C-6″),17.8(C-6‴)。以上数据与文献报道一致，确定为芦丁。
番荔枝叶的生物活性物质主要是黄酮类化合物，有很好的药理活性，本实验建立了两种有效的两步逆流色谱洗脱方法。
第一种方法，传统的逆流色谱和循环逆流色谱模式结合，溶剂体系为乙酸乙酯-正丁醇-水的传统分离模式，实现了化合物1和2及3、4、5良好的分离效果。
循环逆流色谱的分离方法进一步分离1和2化合物。
第二种方法，线性梯度逆流色谱和循环逆流色谱模式结合，0min，100%A；20min，90%A；90min，88%A；210min，88%A；250min，30%A；260min，50%A，350min，50%A，流速为2.0mL/min，进样量为100mg作为LGCCC的最佳条件，实现了化合物1和2及3、4、5良好的分离效果。以乙酸乙酯-水（1:1，v/v）为溶剂体系的循环逆流色谱的分离方法进一步分离1和2化合物。
两种方法均成功分离番荔枝叶提取物中5种黄酮类化合物，各组分经高效液相色谱检测纯度为98%以上，并通过MS和1H和13C（NMR）鉴定CCC中分离出来的化合物结构为槲皮素-3-O-洋槐糖苷、芦丁、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-洋槐糖苷和山奈酚-3-O-芸香糖苷。
HSCCC具有样品零损失的特性，这对筛选天然产物的生物活性成分十分适用，然而，大多数溶剂体系仅限于分离极性范围较窄的组分。
佛手参中化学成分复杂，具有广泛的极性，为了从佛手参提取物中筛选出具有生物活性的化合物，需尽可能的将极性从低到高的成分全部洗脱分离。
相关文献报道，建立梯度逆流色谱溶剂体系可以较好的分离具有广泛极性的天然产物。
佛手参具有良好的药理活性，且化学成分极性范围较大，基于乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂体系适合分离复杂的天然产物成分，本实验构建了乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂体系，通过线性梯度洗脱-清扫-顶出的逆流分离模式分离佛手参粗提取物，并结合制备液相进行第二次分离纯化，成功分离了7种化学成分。
佛手参粗提物和逆流色谱分离组分HPLC分析条件如下：色谱柱SYMMETRY-C18(250mm×4.6mm，5.0um)；流动相为A（水）和B（甲醇）；梯度洗脱条件如下：0min，20%B；10min，46%B；19min，59.5%B；20min，20%B；25min，20%B，停止分析。
流速为1.0mL/min；进样量10uL；检测器波长220nm。
HPLC测定分配系数的方法如下：按乙酸乙酯、正丁醇和水溶剂体系的比例，配制10mL溶剂。
先取2mL下相置于离心管中，再加入等量上相，加入待测粗样约4mg，充分振荡摇匀，静置待分层，各取上下相1mL，置于液相取样瓶，氮气干燥去除溶剂，用1mL甲醇重新溶解，记录HPLC中上下相各目标峰的峰面积，根据溶剂体系体积占比准确量取，置于分液漏斗中震荡混匀，排除气体，静置分层，用分液漏斗将配制的溶剂体系上相和下相分开，初始梯度溶剂体系的下相作为固定相，配制的两种溶剂系统的上相为流动相。固定相与流动相放置于超声清洗机，超声脱气20min。分别记为P1、P2。
计算样品在不同溶剂体系中的分配系数KD，计算公式如下：根据进样量大小和样品溶解情况配制进样溶液，使得样品充分溶解。200、500和700mg样品提取物分别用初始梯度溶剂体系的上下相各4、8、和10mL溶解，备用。
本实验选用乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂体系，乙酸乙酯-水下相为固定相，上相为流动相A，正丁醇-水的上相为流动相B，温度设定25℃，以30mL/min的流速向HSCCC泵满固定相后，选择运行方式“FWD-OUT”、转速800rpm，流动相A设定为5.0mL/min运行HSCCC，溶剂体系在CCC柱内至动态平衡时记录固定相流失体积。连接蒸发光检测仪器，打开无油空气泵、蒸发光检测器和在线记录软件，蒸发光增益值设定为9，称取样品，使
样品溶解于等量的初始固定相和流动相后，注入进样阀。
LGCCC分离实验结束后，进入清扫-顶出的逆流模式。清扫模式方法：更换饱和了正丁醇的水为流动相，直至CCC色谱柱内有水相开始流出。进行顶出模式，方法为停止转速，并调整流速为10mL/min，CCC柱内所有溶质组分全部被洗脱后停止。为了实现良好的分离效果，在分离过程中对LGCCC条件和进样量进行了优化，最佳梯度洗脱条件下，在800rpm转速下测试了三种不同的进样量（200、500和700mg）。
以最佳LGCCC条件进行逆流色谱分离实验，每4分钟收集一瓶（总体积为20mL），顶出模式下每2分钟收集一瓶（总体积为20mL），收集的组分用HPLC检测并将收集的具有相同组分的洗脱溶液进行合并，50℃下进行旋蒸浓缩，直至干燥后，用甲醇重新溶解各分段物质，用注射器和0.45um有机滤膜过滤后分别装入液相取样瓶并标号，对其纯度进行HPLC检测。
逆流色谱未能很好分离的组分，利用制备液相进一步分离纯化。洗脱程序如下：流动
相为A（水）和B（甲醇）；梯度洗脱条件如下：0min，20%B；10min，46%B；19min，59.5%B；20min，20%B；25min，20%B，停止分析。流速为3.0mL/min；进样量40uL（浓度约5mg/mL）；检测器波长220nm。
经HSCCC技术分离获得的7个化合物成分经1H和13C（NMR）进行结构鉴定。在BrukerAV-400波谱仪（德国Rheinsetten，BrukerBioSpin）上，DMSO作溶剂，进行核磁
共振波谱分析。
乙腈和水作为流动相，极性较小的组分分离效果不好。甲醇的洗脱能力比乙腈稍弱，
选用甲醇和水作为流动相，并反复调整洗脱梯度，确定各目标化合物分离效果良好的HPLC分析条件，如图3-1所示。
比较佛手参提取物不同波长下的HPLC色谱图，确定使用HSCCC来分离该提取物时检测所选用的波长，根据HPLC分析检测结果，确定220nm为HSCCC所用检测波长，HPLC分析色谱图，如图3-1所示。
有效的CCC分离依赖于目标化合物在两相溶剂中的分配系数（KD）选择合适的两相
溶剂体系。本实验样品中生物活性物质的极性范围较广，尽可能把样品中不同极性的物质
全部洗脱分离是构建CCC溶剂体系的基本要求。改变溶剂体系中乙酸乙酯相和正丁醇的比例，能够实现流动相极性从低到高的梯度。佛手参提取在乙酸乙酯-正丁醇-水不同溶剂体系的KD值如表2-1所示。
如表3-1中结果所示，目标峰在溶剂体系（乙酸乙酯：正丁醇：水，v/v）中，正丁醇比例逐步增加，对各目标组分洗脱能力逐渐增强，KD值逐渐减小。化合物1、2和6的KD值较小，不含正丁醇时就可以洗脱。
在正丁醇比例30%和40%时，50%、60%和70%时，80%和90%时，KD值在0.5-2之间的化合物分别是7、4和5，由此可见，适合应用于目标分离化合物4、5、7的分离。
化合物3在正丁醇含量100%时，分配系数仍较大，利用清扫模式将其一起分离。目标化合物3和1、2、6采用制备液相的方法进一步分离。
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