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今天推送的文章是发表在Chembiochem.上的“Tuning the Transglycosylation Reaction of a GH11 Xylanase by a Delicate Enhancement of its Thumb Flexibility”，通讯作者是莱顿化学研究所生物化学系的Dr. Fredj Ben Bdira。
糖苷水解酶 (GH) 是多种生物技术应用的有吸引力的工具。结合它们的水解功能，GHs 可以在特定条件下进行转糖基化。在自然界中，寡糖的合成是由糖基转移酶 (GTs) 完成的；然而，GTs 的工业应用受到其溶液不稳定性的限制。GTs 和 GHs 之间的一个主要区别是它们底物结合位点构象的灵活性。采用保留机制的糖苷水解酶使用“Koshland”双置换机制水解糖苷键，使用亲核试剂和酸/碱进行催化。糖基酶加合物是水解和转糖基化反应中常见的中间体。在去糖基化步骤中，水分子或醇在被催化二元酸/碱残基活化后，分别作为酶的正亚位点中的亲核受体。因此，GH 酶可以进行碳水化合物合成，两个反应之间的平衡受 pH 值和温度以及合适受体（如甲醇和乙醇）的可用性的影响。然而，同时存在这两种酶的活性代表了这种合成策略的缺点。这种酶促碳水化合物合成的瓶颈可以通过酶的工程改造来克服，以减少或消除它们的水解活性。比如替换催化残基和使用氟化底物，以及在底物结合亚位点中引入突变提高受体分子的结合亲和力，从而提高了GH 酶的转糖基化效率。
尽管 GH 和 GT 酶具有相似的活性位点结构和拓扑结构，但它们的柔性不同。GT 酶往往柔性更高，这被认为是合成反应的必要条件。相反，GH 的刚性似乎是它们水解功能所必需的。为了获得对转糖基化中柔性作用的新见解，作者用来自环状芽孢杆菌的木聚糖酶(BCX)作为研究材料。BCX 是 GH11 家族成员，表现出保守的 β-折叠卷。由于广泛的氢键网络，该酶有非常大的刚性结构，限制了皮秒到毫秒NMR 时间尺度上的动力学。作者发现，该酶在不改变其在溶液中的构象的情况下，会诱导复合物中底物的扭曲，从而促进糖基酶加合物的形成。BCX 的反平行 β-折叠形成了一个长 25 Å、深 9 Å、宽 4 Å 的结合裂缝。裂缝包括三个负亚位点 (-)和三个正亚位点 ( ), 根据催化机制，断裂的糖苷键位于 -1/ 1 亚位点之间，底物至少占据 -2/-1 和 1 亚位点。BCX 的整体形状常被比作右手的拳头，包括手掌、拇指和手指区域。拇指尖的 PSIXG 序列基序在 GH11 成员中高度保守，表明该发夹环对该功能很重要。 分子动力学研究表明，拇指灵活性的调节可能会影响底物结合和酶结合裂缝中的产物释放。因此，为了在不干扰催化位点残基的情况下重塑柔性区，作者构建了 BCX 突变体，其中拇指残基被甘氨酸或丙氨酸取代。探讨了这些点突变对结构、动力学和活性的影响。顺磁 NMR 和弛豫色散 (RD) NMR 光谱实验表明，高度保守的残基 P116 突变为甘氨酸会引起拇指结构和动力学的细微变化，并讨论了由于突变导致的转糖基化活性转变的可能机制。
BCX 突变体的设计
GH11 家族的一个独特特征是存在拇指环，这是酶底物转换的关键。该环的残基与酶结合裂隙的 -1 和 -2 亚位点处的底物接触。拇指区域显示结构良好的经典发夹结构，包含 I 型 β-转角（BCX 中的残基 111-126）和六个内部氢键。对 GH11 木聚糖酶不同成员的多重分子动力学模拟表明该区域的灵活性以及在底物结合和产物解离中的作用。然而，在 BCX 中，该区域似乎是刚性的，在广泛的动态范围内受到限制，GH11 成员之间拇指柔性的这种差异似乎是由于拇指长度和序列的差异造成的（尽管拇指尖端的 PSIXG 序列基序高度保守）。因此，作者的目的是在拇指的不同位置引入突变，以增强 BCX 在亚位点结合裂缝的柔性，并探讨它们对酶催化反应的影响。第一个突变体是通过用甘氨酸取代残基 P116 设计。该残基在 GH11 的所有成员之间几乎完全保守，表明它对于拇指的特定构型和缩小酶结合裂缝的重要性，从而更好地选择性地处理未修饰的底物。P116 的骨架羰基在 -1 亚位点接受来自糖链 O3 的氢键。通过用甘氨酸代替 P116，拇指环内的刚性可能会降低，从而增加灵活性。拇指的氢键模式被 N114 打断，导致拇指结构急剧弯曲。此外，有研究建议该残基代表 GH11 家族成员 BsXynA 中拇指的铰链点。手掌的R73和拇指尖的D119之间的盐桥稳定了拇指的结构。因此，为了触发拇指的构象自由，作者还分别用甘氨酸和丙氨酸取代了 N114 和 R73。在 BsXynA 中，另一个突变 D11F 允许在拇指的结晶状态下以开放构象捕获拇指尖端，并将其尖端重新定位超过 15 Å。因此，作者推断用甘氨酸取代 D11 也可能通过从 BCX 苷元位点排除氨基酸的庞大侧链来提高灵活性。最后，T126 是将拇指连接到手掌的潜在铰链点。在 BsXynA 中用脯氨酸替代 T126 提高了水解活性，可能是通过增加拇指的刚性来实现的。因此作为对照，作者用 BCX 中的脯氨酸取代了 T126。
点突变的影响
通过Tm值评估在 BCX 中引入的突变对热稳定性的影响。BCX WT 的Tm为 58 °C，突变使Tm降低了1 至 7 °C。对于突变 P116G 和 R73 A 观察到最显著的不稳定效应，可能是由于局部灵活性的增加。突变体 T126P 的Tm与野生型相似，表明对蛋白刚性的影响较小。所有突变体的Tm均高于 50 °C，因此在 40 °C下（WT BCX 的最适温度）使用人工底物4-甲基伞形酮-木二糖苷测量了它们的水解活性。大多数突变体显示水解活性降低 20% 至 30%。其中BCX P116G，减少了 90%。这些发现与之前的研究一致，用甘氨酸或脯氨酸替换 BsXynA 拇指中的残基以调节柔性，降低了酶的活性。然而，在 BCX 中没有观察到 BsXynA T126P 的活性增强。
为了测试 BCX 是否能够在寡糖受体存在下进行糖基转移，将酶与 50 mM对硝基苯基-β - d-木二糖苷 (PNP-X2) 在 30% DMSO 中在 30°C下孵育30 分钟。TLC 显示了几个不同聚合度 (DP) 的产物的条带。HPLC 分离表明反应产物包含 X1、X2 和 X3 寡糖。尽管 X2 可能由 PNP-X2 中糖苷键的水解产生，但 X3 和 X1 只能由转糖基化反应或 DP≥3 的新形成产物的水解产生。观察到的 BCX 的转糖基化反应可能是由于 DMSO 的存在，已知 DMSO 会降低水分子的活性，导致酶-糖基中间体的积累。这促进了寡糖单位从糖基位点转移到酶苷元位点中的受体。因此，作者在水中（不含 DMSO）测试了 20 mM 浓度的 BCX 与木六糖 (X6) 的转糖基化活性。HPLC 分析鉴定出反应混合物中含有 DP7、DP8 和 DP9 的寡糖。此外，由于酶同时具有水解活性，因此同样存在较短的寡糖（DP1、DP2 和 DP3）。在 BCX WT 中确定存在转糖基化活性后，作者测试了拇指区突变对该活性的影响。与其对水解反应的影响相似，大多数拇指突变体对 BCX 的转糖基化反应没有产生重大影响。然而，对于突变体 P116G，观察到更长的寡糖积累，当使用 PNP-X2 作为底物时，生成的产物范围为 3 到 4 个木糖单位。此外，反应混合物中作为水解产物的 X1 和 X2 的量减少。在 20 mM X6 存在下，BCX P116G 反应混合物的 HPLC 分析显示，与野生型酶相比，酶活性更偏向合成长寡糖(高达DP15)的方向，但是该突变体的水解活性降低。
P116G突变对蛋白结构和动力学的影响
通过 P116G 取代观察到的 BCX 活性特异性的变化可能是由于酶结构和动力学的变化。为了研究点突变对 BCX 结构的影响，在 30 °C 下记录了野生型和突变体的15N、1H HSQC 光谱并计算了化学位移扰动（CSP）。P116G 突变导致小 CSP 位于拇指区域内和周围，对拇指区域的残基影响较小。这些 CSP显示了主链酰胺化学环境的变化，这可能是由于脯氨酸取或微小的结构重排。伪接触位移 (PCS) 是对蛋白质内结构变化的敏感探针。BCX WT 和 P116G 突变体的 PCS 是通过引入两个半胱氨酸残基 (T109C/T111C) 获得的，用于连接顺磁性标签 CLANP-5-Yb 3 或抗磁性控制标签 CLANP-5-Lu3 。对于 WT 和突变体 BCX，通过比较15N、1H顺磁性和反磁性样品的HSQC 光谱，用于确定磁化率张量 (Δ χ ) 的各向异性分量的位置、大小和方向。WT BCX的数据与PDB ID 2bvv的晶体结构进行了拟合，镧系元素的位置距离双半胱氨酸Cα约为8 Å，与之前报道的距离一致。实验和预测的PCS之间有很好的一致性。对BCX在不同温度下的分子动力学(MD)模拟表明，拇指区域的运动与温度有关。BsXynA D11F突变体在晶体状态下也有一个完全张开的拇指。在其他GH11成员上的一些MD模拟研究也提出了拇指开关构象的发生。然而，PCS数据不支持这种拇指在BCX中的运动，而是表明蛋白质在20℃和30℃时的构象是相同的。同样，用PCS模拟催化循环的中间体结构时发现，主链也没有发生大的变化。因此，作者认为拇指没有完全打开，也不是 BCX 功能所必需的。
对于BCX P116G，由于顺磁弛豫增强(PRE)引起的谱线增宽，导致有几个拇指的酰胺核不能被确定。而拇指区残基D119、G120、D121和R122的PCS可以测量，变宽表明，相对于顺磁中心，突变拇指的空间构型接近。BCX WT和P116G突变体(|ΔPCS|)观察到的PCS差异的绝对值表明该蛋白的拇指结构发生了高度局部的结构变化，而蛋白质骨架的其余部分不受干扰。毫秒级的结构运动可以以不同的方式影响酶的底物周转。它可以使水分子从活性位点被排除，优化底物或蛋白催化残基的位置，并帮助从结合位点释放产物。因此，为了探究P116G突变对BCX毫秒动力学的影响，进行了弛豫色散 TROSY-CPMG实验。之前，作者观察到BCX WT对一些远离催化位点的残基表现出较小的化学交换(Rex)。P116G 突变略微增强了底物结合位点上拇指区和手指区氨基酸残基的微秒级化学交换。
综上所述，这些数据表明，P116G突变引起了结构变化，并在一定程度上增强了位于BCX拇指区域的毫秒动力学。loop环的构象变化可能暴露了拇指和手掌之间的疏水界面，这可以解释Tm的大幅下降。
End
整理：董如月
DOI：10.1002/cbic.202000856
