酶是大分子，其分子量一般在一万以上，由数百个氨基酸组成。而酶的底物一般很小，直接与底物接触并起催化作用的只是酶分子中的一小部分。即使有些酶的底物较大，但与酶接触的也只是一个很小的区域。所以，我们把酶分子中与底物结合并催化反应的场所称为酶的活性中心。
乳酸脱氢酶与底物
活性中心是由酶分子中少数几个残基构成的，它们在一级结构上可能相距很远，甚至位于不同的肽链上，由于肽链的盘曲折叠而互相接近，构成一个特定的活性结构。因此活性中心不是一个点或面，而是一个小的空间区域。
酶的活性中心，引自百度百科
活性中心的氨基酸按功能可分为底物结合部位和催化部位。前者负责识别特定的底物并与之结合。它们决定了酶的底物专一性。后者是起催化作用的，底物的敏感键在此被切断或形成新键，从而生成产物。二者的分别并不是绝对的，有些基团既有底物结合功能又有催化功能。
Koshland将酶分子中的残基分为四类：接触亚基负责底物的结合与催化，辅助亚基起协助作用，结构亚基维持酶的构象，非贡献亚基的替换对活性无影响，但对酶的免疫、运输、调控与寿命等有作用。前二者构成活性中心，前三者称为酶的必须基团。
糜蛋白酶与TCK
活性中心以外的部分并不是无用的，它们能够维持酶的空间结构，使活性中心保持完整。在酶与底物结合后，整个酶分子的构象发生变化，这种扭动的张力使底物化学键容易断裂。这种变化也要依靠非活性中心的协同作用。
一般单体酶只有一个活性中心，但有些多功能酶具有多个活性中心。大肠杆菌DNA聚合酶I是一条109 kd的肽链，既有聚合酶活性，又有外切酶活性。下图是一种芽孢杆菌的DNA聚合酶I，聚合酶活性中心位于左侧与DNA结合的结构域，外切酶活性中心位于右侧结构域。
芽孢杆菌DNA聚合酶I
活性中心的基团反应性常与其他基团不同，所以一些试剂可以专一性地与活性中心中的某种残基反应，而不与活性中心外的残基作用。如DFP（二异丙基氟磷酸）只能与活性中心中的丝氨酸反应。而TPCK（N-对甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲基酮）的专一性更强，只能与糜蛋白酶活性中心的His-57结合，称为亲和标记。
糜蛋白酶与TCK的相互作用
当没有专一性试剂时，可用差示标记法：先用底物类似物保护活性中心，再加入修饰剂，与活性中心以外的基团反应，然后除去底物类似物，再加入同位素或荧光标记的试剂，此时试剂只能与活性中心的基团反应，所以被标记的就是活性中心。
紫外、荧光、园二色光谱等方法也可用与活性中心的研究。在酶与底物结合时，位于底物结合部位的生色团必然会发生某种变化，从而导致其光谱的变化。这些生色团可以是酶本身带有的，也可以人工引入。这种方法可以用来判断活性中心的构成，也可以研究催化的反应过程。
