FPtag-C(cd):用于GOIC端标记的荧光蛋白模块(bc)
我们为GFP、mCherry和ECFP(#8)制作了模块,每个FPtag模块都带有一个接头序列,其中包括JB9F序列。
JB19F序列由19个碱基组成,缺少常用于pFA20a质粒的6个碱基的Fwd序列的第一个碱基。
JB19F和链接器的实际序列如下:5'-aGGATCCCCGGGTTAATTAAgGGAGCAGGTGCTGGTGCTGGTGCTGGAGCATTTTCCGTCCCCATTACAACAGCTAGC-3'(下划线表示JB19F),该模块的氨基酸序列是RIPGLIKGAGAGAGAGAFSVPITTAS。
FPcontrol-C (bd):不带GOI的控制结构(bc)
在构建对照菌株时,我们可能需要创建没有GOI(Gene of Interest)的FPtag模块,在这种情况下,可以使用控制FPtag模块来替代模块II和III。
每个控制FPtag模块都包含一个FPtag,其两侧分别具有内聚端"b"和"d",因此可以直接连接到启动器模块(I)和选择标记模块(IV),可以通过使用控制模块来构建对照菌株,而无需加入GOI。
当希望表达没有荧光蛋白标签的GOI时,该GOI片段应该在5'和3'端分别制备具有内聚性末端"b"和"d"的序列,就可以直接将GOI与启动器和终止子模块连接起来,而无需使用FPtag模块。
虽然我们没有包含FLAG和HA标签的模块质粒,但可以通过将这些标签序列包含在寡核苷酸引物中,用于扩增GOI并实现标记的目的。
终结器和选择标记模块为了终止GOI的转录,需要一个包含终止子的模块,通常情况下,使用adh1基因(Tadh1)的终止子来表达外部基因。
选择标记对于筛选经过正确转化和同源*的阳性菌落是必要的,已经制备了几种选择标记。